李 軍，陳澤祥，楊 威，謝永平，李常挺，傅啟寬，駱永泉，李常春，許力干，趙 武

家畜布魯氏菌?。˙r ucellosis）是由布魯氏菌（Br ucell a）引起的一種人獸共患傳染病，在全世界廣泛分布，其主要癥狀表現(xiàn)為生殖器官和胎膜發(fā)炎、流產(chǎn)、不育及各種組織的局部病灶［1－2］。豬、牛、羊是布魯氏菌的主要宿主，病菌通過(guò)流產(chǎn)胎兒、胎衣、羊水、子宮和陰道分泌物、精液、乳汁等排出體外，傳染其它家畜和人類(lèi)，給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為二類(lèi)傳染病。

廣西在1952年開(kāi)始有豬布魯氏菌病的流行和傳播，由于未采取有力防治措施，疫情擴(kuò)散較快，至1961年疫情擴(kuò)大到16個(gè)縣（市）。1981年對(duì)廣西布魯氏菌病疫情普查顯示，在當(dāng)時(shí)行政劃分的86個(gè)縣（市）中，有畜間疫情的縣（市）為53個(gè)，有人間疫情的縣（市）為47個(gè)。1982年至1985年，畜間平均陽(yáng)性率為4．98%，人間發(fā)病人數(shù)為463人［3－4］。

廣西于1980年開(kāi)展家畜布魯氏菌病的防治工作，到2007年全自治區(qū)14個(gè)市的家畜布魯氏菌病防治效果達(dá)到了國(guó)家農(nóng)業(yè)部頒布的穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)并通過(guò)驗(yàn)收，所有家畜不再進(jìn)行疫苗免疫［5］。

近幾年來(lái)隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，廣西牛、羊的飼養(yǎng)量日益增多，家畜的盲目引種和無(wú)序流動(dòng)也日漸頻繁，導(dǎo)致家畜布魯氏菌病疫情隨時(shí)有反彈的可能。為此，2009－2011年對(duì)廣西14個(gè)市的家畜開(kāi)展布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)工作，以便及時(shí)掌握疫情動(dòng)態(tài)，防止和控制布魯氏菌病的發(fā)生和傳播，保護(hù)人畜健康。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑和儀器 布魯氏菌虎紅凝集抗原和凝集試管抗原購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；布魯氏菌液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司、胰蛋白示購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司、馬血清購(gòu)自美國(guó)Ther mo公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Mar ker 2購(gòu)自廣東東盛生物科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。PCR儀購(gòu)自日本Ta Ka Ra公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司。

1．1．2 被檢血清 2009－2011年對(duì)廣西南寧、桂林、柳州、北海、欽州、防城港市、玉林、百色、河池、賀州、貴港、崇左、來(lái)賓和梧州14個(gè)市35個(gè)縣（區(qū)）內(nèi)的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)殖小區(qū)和農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)按比例進(jìn)行家畜血清抽檢，著重對(duì)老疫區(qū)和新引進(jìn)家畜的檢測(cè)，共采集家畜血清16 143份，其中豬血清10 123份、牛血清4 767份、羊血清1 253份。

1．1．3 被檢病料 采集自廣西14個(gè)市的395份豬、588份牛、87份羊的脾、胎衣、流產(chǎn)胎兒以及布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗體陽(yáng)性家畜的內(nèi)臟、子宮或睪丸。采集病料裝入密封袋后立即冷藏送檢；不能即送的，置－20℃冷凍后送檢。

1．2 方法

1．2．1 檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB／T18646－2002》進(jìn)行。采用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清樣本初篩，陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性的血清樣本再用試管凝集方法進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)試管凝集方法確認(rèn)的抗體陽(yáng)性家畜進(jìn)行撲殺，采集病料進(jìn)行布魯氏菌分離。

1．2．2 布魯氏菌分離和鑒定 將采集的家畜胎衣、流產(chǎn)胎兒以及布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗體陽(yáng)性家畜的內(nèi)臟、子宮或睪丸用無(wú)菌生理鹽水清洗后，在無(wú)菌條件下將流產(chǎn)胎兒的肝、脾、腎、淋巴結(jié)以及布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗體陽(yáng)性家畜的內(nèi)臟、子宮或睪丸、胎衣接種在含5%馬血清的胰蛋白示瓊脂培養(yǎng)基（胰蛋白示20 g，葡萄糖1 g，氯化鈉5 g，馬血清50 m L，瓊脂20 g，水1 000 m L）中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)觀察7 d。應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)基上濕潤(rùn)、光滑、圓形、革蘭氏染色為陰性小桿菌的細(xì)菌基因組DNA，按陳澤祥等建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行布魯氏菌的PCR鑒定［6］。按伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（8版）進(jìn)行布魯氏菌的生化特性鑒定［7］。按鐘旗等建立的方法進(jìn)行布魯氏菌種型的PCR鑒定［8］，將PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1．2．3 布魯氏菌毒力基因Vir B8的擴(kuò)增和序列比較 應(yīng)用鐘旗等建立的方法對(duì)分離到的布魯氏菌進(jìn)行毒力基因Vir B8的PCR擴(kuò)增［9］。利用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收純化后與p MD－18T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序序列與Gen Bank中登錄的各布魯氏菌種型的Vir B8基因序列進(jìn)行比較（表1）。

2 結(jié) 果

2．1 血清檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用虎紅平板凝集和試管凝集方法對(duì)2009－2011年采集自廣西14個(gè)市的10 123份豬血清、4 767份牛血清和1 253份羊血清進(jìn)行布魯氏菌病抗體檢測(cè)。在2009年有1頭種公豬，2010年有1頭牛和8頭山羊被檢出為布魯氏菌抗體陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性家畜均來(lái)自農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

2．2 布魯氏菌的分離和鑒定 對(duì)采集的395份豬、588份牛、87份羊的脾、胎衣、流產(chǎn)胎兒以及10份布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗體陽(yáng)性家畜的內(nèi)臟進(jìn)行布魯氏菌分離和鑒定。經(jīng)布魯氏菌PCR鑒定有1株從布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗體陽(yáng)性羊分離的細(xì)菌被鑒定為布魯氏菌（圖1）。

表1 用于序列比較的菌株信息Tab．1 Bacterial strains infor mation for sequences comparison in this study

圖1 布魯氏菌PCR鑒定結(jié)果M．DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2；1．羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗；2．1105菌株；3．陰性Fig．1 Brucella identification by PCR M：Mar ker 2；1：Br ucella melitensis vaccine No．5；2：Strain 1105；3：Negative control

表2 2009－2011年廣西家畜布魯氏菌病血清檢測(cè)結(jié)果Tab．2 Serological test of livestock br ucellosis in Guangxi during 2009－2011

分離的布魯氏菌生化特性結(jié)果顯示，該菌能在流堇培養(yǎng)基（1∶5萬(wàn)）和堿性復(fù)紅培養(yǎng)基（1∶5萬(wàn)）上生長(zhǎng)；不產(chǎn)生H2S；不利用L－阿拉伯糖、D－核糖；利用葡萄糖、木糖、半乳糖和赤蘚醇，其生化特性符合羊種布魯氏菌（B．melitensis）的生化特性。

利用A MOS－PCR對(duì)分離的布魯氏菌進(jìn)行種型鑒定，PCR電泳結(jié)果顯示在731 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖2）。將PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明為羊種布魯氏菌，將此菌命名為1105。

2．3 布魯氏菌毒力基因Vir B8的擴(kuò)增和序列比較

按鐘旗等建立的方法對(duì)布魯氏菌1105株提取的基因組DNA進(jìn)行Vir B8基因的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示獲得720 bp的目的片段（圖3）。

對(duì)目的片段進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序。將測(cè)序獲得的核苷酸序列與參考序列進(jìn)行比較，1105與羊種布魯氏菌16 M強(qiáng)毒株和羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗（M5）株的同源性為100%；與其它種布魯氏菌的同源性在99．7%～99．9%之間（圖4）。羊種布魯氏菌

圖2 羊種布魯氏菌PCR鑒定結(jié)果M．DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2；1．陰性；2．羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗；3．1105菌株Fig．2 Brucella melitensis identification by PCR M：Mar ker 2；1：Negative control；2：Br ucell a melitensis vaccine No．5；3：Strain 1105

Vir B8核苷酸序列與其它種布魯氏菌核苷酸序列的差異是在第576位核苷酸處有一個(gè)變異（C→T），但是這一變異屬于同義突變，并未導(dǎo)致編碼氨基酸的改變。

3 討 論

廣西14個(gè)市2009－2011年的家畜布魯氏菌病監(jiān)測(cè)結(jié)果表明近3年廣西家畜布魯氏菌病血清陽(yáng)性率均在0．2%以下，仍然在穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)要求內(nèi)。廣西家畜布魯氏菌病防治取得顯著效果，主要是得到各級(jí)政府主管部門(mén)的重視和大力支持，將家畜布魯氏菌病防治工作納入工作范圍，做到家畜布魯氏菌病防治措施層層落實(shí)，從上至下都有專(zhuān)人抓管；防治經(jīng)費(fèi)也年年落實(shí)，使基層工作人員開(kāi)展防治工作獲得一定的經(jīng)費(fèi)補(bǔ)助，被撲殺病畜的畜主也得到一定的經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償。

2000年以前，因經(jīng)濟(jì)條件和養(yǎng)殖模式限制，廣西家畜養(yǎng)殖以養(yǎng)豬為主，牛和羊的飼養(yǎng)量較少，家畜布魯氏菌病主要是在豬流行，以豬種布魯氏菌生物3型常見(jiàn)，牛和羊基本無(wú)疫情［3，10］。2000年以后，政府大力支持發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)，廣西的畜牧業(yè)得到快速發(fā)展，不少農(nóng)戶(hù)將牛、羊養(yǎng)殖作為致富手段，但是他們對(duì)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》和《種畜禽管理?xiàng)l例》缺乏了解，沒(méi)有申報(bào)就盲目私自從外省購(gòu)買(mǎi)家畜，更未進(jìn)行布魯氏菌病的檢疫。2002年牛種布魯氏菌病疫情和2004年羊種布魯氏菌病疫情就是通過(guò)無(wú)序引種的方式引入廣西［11－12］。2010年檢出的9例布魯氏菌病抗體陽(yáng)性家畜也是畜主未經(jīng)畜牧行政主管部門(mén)許可，就私自從外省引回當(dāng)?shù)?。在監(jiān)測(cè)中，我們還發(fā)現(xiàn)農(nóng)戶(hù)引種渠道混亂，從多個(gè)地方引種并群的現(xiàn)象非常普遍，造成病源追溯的困難。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)廣大農(nóng)戶(hù)宣傳家畜布魯氏菌病防治知識(shí)，增強(qiáng)農(nóng)戶(hù)的風(fēng)險(xiǎn)防范意識(shí)。同時(shí)各縣、市動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)應(yīng)更加重視對(duì)動(dòng)物引種的管理和動(dòng)物流通環(huán)節(jié)的檢疫，指導(dǎo)農(nóng)戶(hù)合法地從家畜布魯氏菌病穩(wěn)定控制地區(qū)進(jìn)行引種。引種落地后對(duì)家畜進(jìn)行1個(gè)月的隔離檢疫，檢測(cè)合格后方可解除隔離。

2009年檢出的1例布魯氏菌病抗體陽(yáng)性豬來(lái)自家畜布魯氏菌病老疫區(qū)，目前廣西部分家畜布魯氏菌病老疫區(qū)仍存在防疫條件差，疫源未能徹底清除的問(wèn)題；同時(shí)一些鄉(xiāng)鎮(zhèn)或村級(jí)獸醫(yī)防治人員對(duì)家畜布魯氏菌病需要長(zhǎng)期和艱苦的工作才能控制的形勢(shì)認(rèn)識(shí)不足，個(gè)別人員沒(méi)有如實(shí)匯報(bào)種用家畜來(lái)源和養(yǎng)殖信息，或是沒(méi)能及時(shí)完成采樣檢測(cè)任務(wù)等，防治工作存在應(yīng)付和被動(dòng)現(xiàn)象。因此，應(yīng)定期在各縣、市舉辦家畜布魯氏菌病防治學(xué)習(xí)班，對(duì)基層獸醫(yī)防治人員進(jìn)行業(yè)務(wù)培訓(xùn)，提高他們的防治水平。

繼續(xù)在廣西14個(gè)市實(shí)施家畜布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)工作，著重對(duì)老疫區(qū)的豬以及各縣、市新引進(jìn)牛、羊的檢疫工作，準(zhǔn)確掌握疫情信息。根據(jù)農(nóng)村散養(yǎng)地區(qū)豬布魯氏菌病的主要傳播途徑為患病公豬這一特點(diǎn)，在農(nóng)村散養(yǎng)地區(qū)推廣普及人工授精技術(shù)，提高配種范圍和配種率，切斷豬布魯氏菌病的傳播途徑。

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)繁殖和形成持續(xù)性感染所必需的一個(gè)毒力因子，它由Vir B1－Vir B12共12個(gè)蛋白組成［13］。Vir B8是布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵因子，屬于早期分泌蛋白，在抵抗細(xì)胞吞噬和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中起主要作用。研究證實(shí)Vir B8基因缺失的布魯氏菌變異株毒力較親本菌株弱，感染巨噬細(xì)胞的能力顯著降低［14－16］。我們對(duì)分離的羊種布魯氏菌 1105進(jìn)行Vir B8基因克隆和測(cè)序，序列比較顯示Vir B8基因在布魯氏菌種型間高度保守。鑒于Vir B8基因與細(xì)菌的侵襲力密切相關(guān)且在布魯氏菌種型間的高度保守，因此，對(duì)Vir B8基因的深入研究將為布魯氏菌疫苗的研制、早期診斷試劑的開(kāi)發(fā)提供線(xiàn)索。

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