梅玲玲，潘雪霞，朱 敏，張俊彥，龔 璞，潘軍航，占 利

副溶血性弧菌（Vibrio par ahaemol yticus，VP）又稱致病性嗜鹽菌、腸炎弧菌，主要生存于近岸海水和魚貝類等海產(chǎn)品中［1－3］。自1951年藤野等報告該菌以來，許多國家相繼有病例報道，至今已成為沿海國家或地區(qū)的重要食物中毒和夏季腹瀉的重要病原菌之一。日本每年由本菌引起的食源性疾病占細(xì)菌性食源性疾病的40%～60%［4］。中國位居食源性疾患的前3位。

浙江省是一個沿海省份，有著廣闊的海域和豐富的水產(chǎn)品，本地居民愛吃海產(chǎn)品，歷來有生食或半生食貝類、甲殼類等海產(chǎn)品的習(xí)慣。并且，隨著外來飲食文化的影響，生食半生水食產(chǎn)品現(xiàn)象為我省越來越多的消費者所接受。近十年來，副溶血弧菌污染引起的食源性疾病暴發(fā)疫情已成為我省突出的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人民的身體健康并造成經(jīng)濟(jì)財產(chǎn)的損失。

為進(jìn)一步了解我省各類食品中副溶血性弧菌污染水平，以及對消費者的危害程度，于2009年－2010年，對散裝熟肉制品、水產(chǎn)品等四大類11種2 215件食品進(jìn)行副溶血性弧菌檢測的同時，進(jìn)行牡蠣、毛蚶等生食或半生食貝類海產(chǎn)品副溶血性弧菌感染風(fēng)險評估?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1．1 樣品來源 樣品采自杭州市、寧波市、溫州市、舟山市等11個地級市和義烏市農(nóng)貿(mào)市場、超市或養(yǎng)殖場，共計2 215件。

1．2 標(biāo)準(zhǔn)菌株和試劑 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802、ATCC 33847由中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)和食品安全所贈送；Ta Ka Ra Taq（DR001）、100 bp DNA Ladder Mar ker購自寶生物工程（大連）有限公司；API 20E鑒定條購自法國梅里埃公司；科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；堿性蛋白胨水（APW）、3．5%NaCl三糖鐵瓊脂（TSI）、3．5%Na Cl胰酪胨大豆瓊脂（TSA）購自北京陸橋生物制品有限公司。所有培養(yǎng)基均經(jīng)質(zhì)量鑒定符合要求并在有效期內(nèi)使用。

1．3 副溶血性弧菌分離、鑒定、計數(shù)方法 樣品處理：牡蠣等貝殼類樣品在自來水下刷洗外殼，用75%酒精棉球消毒外殼并拭干，無菌開殼，取出軟組織和內(nèi)容水作為檢樣。其它樣品不經(jīng)任何處理，直接作為檢樣。稱取檢樣25 g，加入225 m L無菌堿性蛋白胨水，均質(zhì)制成10－1稀釋液，用堿性蛋白胨水依次制備成10－2、10－3、10－4、10－5稀釋液。

定性檢測：將上述10－1稀釋液于36℃±1℃培養(yǎng)18 h。用接種環(huán)分別取上述培養(yǎng)后的堿性蛋白胨水增菌液分別劃線接種科瑪嘉弧菌顯色瓊脂平板。置37℃培養(yǎng)24 h。挑取可疑菌落，應(yīng)用法國梅里埃API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。

定量檢測：用滅菌吸管吸取上述5種濃度稀釋液1 m L，接種于含有9 m L 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)。每個稀釋度接種3管，每管接種1 m L。置36℃±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)12 h。用接種環(huán)在每管挑取一環(huán)增菌液分別劃線接種科瑪嘉弧菌顯色瓊脂平板。然后按定性檢測方法進(jìn)行副溶血性弧菌分離鑒定。最后，根據(jù)副溶血性弧菌陽性試管數(shù)，查MPN表得出副溶血性弧菌的最終計數(shù)結(jié)果。

1．4 t dh、tr h毒力基因檢測方法 （1）模板制備：挑取單個菌落于裝有100μL dd H2O的Eppendorf管中，100℃裂解10 min，12 000 r／min離心5 min，取上清作為模板DNA 4℃ 保存?zhèn)溆谩＃?）引物與探針：針對t dh、tr h毒力基因設(shè)計引物序列（表1），由Ta Ka Ra公司合成。（3）tdh、tr h基因的檢測：PCR反應(yīng)總體系為20μL：5 U／μL Ta Ka Ra Taq 0．1μL、20μmol／L tdh基因和tr h 基因引物各0．1 μL，模板 DNA 2μL，10×PCR Buff er 2μL，25 mmol／L Mg Cl21．2μL，2．5 m M d NTP 1．6μL，用dd H2O補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min。94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。72℃延伸5 min，4℃下保存。產(chǎn)物經(jīng)1．5%的瓊脂糖凝膠電泳，用BIO－RAD凝膠成像儀觀察并保存結(jié)果。t dh基因擴(kuò)增條帶大小為434 bp，tr h基因擴(kuò)增條帶大小為250 bp。

表1 tdh、tr h基因引物序列Tab．1 Primers for PCR amplification of tdh and tr h genes

1．5 副溶血性弧菌模擬烹飪滅菌效果試驗 取副溶血性弧菌ATCC33847單菌落接種于150 m L 3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌液，36℃±1℃增菌8 h后，分裝至15 mm×15 mm玻璃試管，每管10 m L，共計30管。取25只管子放入較大的沸水浴中，0．5 min后取出5管立即放入5℃冷水中降溫，以后每隔0．5 min取出5管，用同法降溫。用平板計數(shù)法計數(shù)不同加溫時間對副溶血性弧菌的滅菌率。以此模擬不同烹飪時間對副溶血性弧菌滅菌效果。

1．6 風(fēng)險評估方法 副溶血性弧菌感染風(fēng)險評估采用 Risk Ranger軟件〔5－6〕。評估參數(shù)設(shè)置見表2。

表2 副溶血性弧菌風(fēng)險評估參數(shù)設(shè)置情況表Tab．2 Parameter settings of V．par ahaemol yticus risk assessment

2 結(jié) 果

2．1 不同食品中副溶血性弧菌污染狀況監(jiān)測結(jié)果對4大類11種2 215件食品進(jìn)行副溶血性弧菌定性檢測結(jié)果，2 215件食品樣品共檢出副溶血性弧菌402株，總檢出率為18．15%（402／2 215）。

在所有被檢食品中，副溶血性弧菌的檢出率以海水產(chǎn)品為最高，715件樣品檢出副溶血性弧菌269株，檢出率達(dá)37．62%，占總檢出數(shù)的66．92%。其中，鮮（活）海水產(chǎn)品副溶血性弧菌檢出率更是高達(dá)43．06%，泥螺、牡蠣等生食海產(chǎn)品副溶血性弧菌檢出率也達(dá)到了32．52%（120／369）。在生畜肉中的溶血性弧菌檢出率為13．52%（38／281），在生禽肉中為11．44%（31／271）。另外，在散裝熟肉制品、生食蔬菜、中式?jīng)霭璨撕王r奶蛋糕中均檢出副溶血性弧菌，檢出率分別為3．44%（15／436）、2．10%（2／70）、2．98%（5／168）和2．08%（2／94）（表3）。

根據(jù)季節(jié)分布，4月～6月份副溶血性弧菌檢出率為6．67%（17／225），8月～10月份副溶血性弧菌檢出率為33．99%（69／203），8月～10月副溶血性弧菌檢出率顯著高于4月～6月（P＝0＜0．01，χ2＝46．445）。

從采樣地點看，在農(nóng)貿(mào)市場采集的食品副溶血性弧菌檢出率為23．15%（69／298），超市采集的食品為13．47%（47／349）兩者存在顯著差異（P＝0．001＜0．01，χ2＝10．252）。其中水產(chǎn)品副溶血性弧菌檢出率兩地?zé)o顯著性差異（P＝0．836＞0．05，χ2＝0．043），而生畜肉農(nóng)貿(mào)市場樣品檢出率顯著性高于超市樣品（P＝0．018＜0．05，χ2＝5．636），生禽肉農(nóng)貿(mào)市場樣品檢出率高于超市樣品（P＝0．001＜0．01，χ2＝11．144）（表4）。

表3 不同食品中副溶血性弧菌污染狀況Tab．3 Pollution status of V．par ahaemol yticus from foods

2．3 tdh、tr h毒力基因檢測檢測結(jié)果 隨機(jī)選擇82株副溶血性弧菌采用PCR方法檢測，結(jié)果3株副溶血性弧菌tdh毒力基因陽性，所有菌株未檢測到trh毒力基因。tdh毒力基因攜帶率為3．66%（3／82）。

2．4 副溶血性弧菌模擬烹飪滅菌效果試驗結(jié)果分別采用0．5 min、1 min、1．5 min、2 min 4種煮沸時間對副溶血性弧菌進(jìn)行模擬烹飪殺菌效果試驗結(jié)果，濃度為4．5×106CFU／m L副溶血性弧菌經(jīng)1．0 min煮沸后，濃度下降至3．0×103CFU／m L。2 min后，所有細(xì)菌均被殺滅，滅菌率100%。

2．5 貝類海產(chǎn)品副溶血性弧菌感染風(fēng)險評估結(jié)果

根據(jù)2002年浙江省居民膳食營養(yǎng)攝入狀況調(diào)查結(jié)果，按我省常住人口5 440萬，流動人口2 000萬、1%人口每年攝取牡蠣1次、副溶血性弧菌感染劑量106CFU／g、不經(jīng)加熱直接生食，根據(jù)副溶血性弧菌污染水平、毒力基因攜帶率監(jiān)測結(jié)果，采用Risk Ranger分析軟件分析，預(yù)期我省因生食或半生食牡蠣等貝類海產(chǎn)品每天副溶血性弧菌暴露人口為1．02×104人，每年因食用牡蠣等貝類海產(chǎn)品導(dǎo)致副溶血性弧菌食源性疾病的人數(shù)為4．42×104人，風(fēng)險系數(shù)為50，牡蠣等生食或半生食貝類海產(chǎn)品屬于高風(fēng)險食品。

表4 不同采集地點副溶血性弧菌檢出率（%）Tab．4 Detection rates of V．par ahaemolyticus from different sampling places（%）

圖 1 M：100 bp DNA Ladder Mar ker；1：09－W－杭 州－2（112）；2：10－W－舟 山－372；3：10－W－衢 州－429；4：10－W－義烏－516；5：10－W－杭州－538；6：09－W－江 干－125 ；7：09－W－江 干－144；8：09－Y－玉 珠－11；9：10－W－臨 海－161；10：09－Y－寧波－492；11：10－Y－江干－83；12：副溶血性弧菌 ATCC 17802；13：副溶血性弧菌 ATCC 33847；14：陰性對照Fig．1 Amplification of tdh and tr h genes by PCRM：100 bp DNA Ladder Mar ker；1：09－W－Hangzhou－2（112）；2：10－W－Zhoushan－372；3：10－WQuzhou－429；4：10－W－Yi wu－516；5：10－W－Hangzhou－538；6：09－W－Jianggan－125；7：09－W－Jianggan－144；8：09－Y－Yuzhu－11；9：10－W－Linhai－161；10：09－Y－Ningbo－492；11：10－Y－J－83；12：Vibrio par ahaemol yticus ATCC 17802；13：Vibrio par ahaemol yticus ATCC 33847；14：Negative Contr ol

在其它條件不變的情況下，如果通過短時加熱，約50%的副溶血性弧菌被滅活，經(jīng)Risk Ranger分析軟件分析，預(yù)期我省因生食或半生食牡蠣等貝類海產(chǎn)品的風(fēng)險系數(shù)為48，每天副溶血性弧菌暴露人口仍為1．02×104人，每年因食用牡蠣等貝類海產(chǎn)品導(dǎo)致副溶血性弧菌食源性疾病的人數(shù)為2．21×104人。

如果烹飪徹底，100%的副溶血性弧菌被殺滅。經(jīng)Risk Ranger分析軟件分析結(jié)果風(fēng)險系數(shù)降至零。

3 討 論

副溶血性弧菌是食源性疾病的主要致病菌之一。食品中污染副溶血性弧菌，在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都是影響食品安全的主要因素。本研究結(jié)果顯示，浙江省各類食品中副溶血性弧菌污染問題突出，在水產(chǎn)品、生畜肉、生禽肉、散裝熟肉制品、生食蔬菜、中式?jīng)霭璨撕王r奶蛋糕等食品中均有副溶血性弧菌檢出。尤其是我省居民有生食半生食習(xí)慣的牡蠣等貝類海產(chǎn)品副溶血性弧菌檢出率達(dá)到了32．52%，分離菌株副溶血性弧菌t dh毒力基因攜帶率為 3．66% （3／82）。結(jié) 果 與 潘 幸 福 報 道 基 本一致［1］。

從對不同采樣地點監(jiān)測結(jié)果來看，采自超市的生畜肉和生禽肉副溶血性弧菌檢出率顯著低于采自農(nóng)貿(mào)市場樣品，分析原因可能是超市管理制度較為完善，各類食品分區(qū)銷售，污染幾率低。由此結(jié)合副溶血性弧菌嗜鹽的生長特性推測副溶血性弧菌傳播途徑首先海水產(chǎn)品本身攜帶了較高的副溶血性弧菌，通過市場流通環(huán)節(jié)，污染率進(jìn)一步提高，同時污染至鮮凍淡水產(chǎn)品、生畜肉、生禽肉等附近區(qū)域銷售的其它食品，最后通過食品加工人員生熟不分等原因污染至直接食用的生食蔬菜、中式?jīng)霭璨撕褪卟松?、熟制水產(chǎn)品、熟肉制品等即食食品，這也可從超市管理制度較為完善，各類食品分區(qū)銷售，海水產(chǎn)品以外其它食品副溶血性弧菌污染率顯著低于農(nóng)貿(mào)市場這一現(xiàn)象得到進(jìn)一步證實。

Risk Ranger為半定量風(fēng)險評估軟件，該評估軟件通過回答11個問題，最終用從0到100之間的數(shù)字來表示風(fēng)險的級別。其中，0代表沒有風(fēng)險，小于32為低風(fēng)險，32～48之間為中度風(fēng)險，大于48為高度風(fēng)險。本次風(fēng)險評估生食或半生食牡蠣等貝類海產(chǎn)品風(fēng)險系數(shù)分別為50（生食）和48（半生食），如果烹飪徹底，風(fēng)險系數(shù)降可至零。因此作者認(rèn)為防止食品間交叉污染，不生食半生食海水產(chǎn)品，即食食品食用前加熱處理應(yīng)是減少副溶血性弧菌食源性疾病發(fā)生的最有效方法。

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