改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法在抗真菌藥物體外敏感性試驗(yàn)中的應(yīng)用研究

陳思敏，何巧，諶立巍

隨著時(shí)代的發(fā)展，嚴(yán)重的真菌感染逐漸增加。真菌感染、尤其是免疫力低下者機(jī)會性真菌感染發(fā)病率的不斷上升，使真菌的治療面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。大量抗真菌藥物的面世，對臨床真菌感染性疾病的治療帶來了新的轉(zhuǎn)機(jī)，同時(shí)關(guān)于耐藥的報(bào)道也日益增多[1]?，F(xiàn)階段，中醫(yī)藥現(xiàn)代化的高速發(fā)展，涌現(xiàn)了一批很有代表性的抗真菌中成藥及中藥有效成分，如何對這類藥物進(jìn)行抗真菌體外敏感性評價(jià)，預(yù)測臨床抗菌療效就成為一個(gè)突出而迫切需要解決的問題。全世界多個(gè)實(shí)驗(yàn)室多以美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室（CLSI，前NCCLS）推薦的M27-A[2]方案和M38-A，采用液體培養(yǎng)基稀釋法（包括試管法和微量法）對酵母菌和絲狀真菌[3]進(jìn)行抗真菌藥物體外敏感性試驗(yàn)，取得了較好的一致性和穩(wěn)定性。但是，對于中成藥或中藥提取物，其成分復(fù)雜，溶解性不理想，通過肉眼判斷真菌是否生長不準(zhǔn)確。因此在方法學(xué)上需要找到一種和CLSI方案一致，又適用于中藥研究的體外敏感性試驗(yàn)方法。本研究采用CLSI M27-A2推薦的微量液體培養(yǎng)基稀釋法和改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法同時(shí)測定20株臨床近期分離無重復(fù)白色念珠菌對伊曲康唑的體外敏感性，初步比較兩種方法的一致性，為建立實(shí)用性更強(qiáng)、直觀、簡便、快捷的抗真菌體外藥物敏感性試驗(yàn)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 臨床分離菌株 均為2012年7月～2012年8月從四川省內(nèi)三級甲等醫(yī)院住院患者體內(nèi)分離的無重復(fù)臨床致病白色念珠菌，標(biāo)本主要由皮膚、生殖系統(tǒng)等感染病患者的分泌物臨床標(biāo)本中分離。所有分離菌株經(jīng)分離單位鑒定，并含有一定比例耐藥菌株。1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株 白色念珠菌ATCC 90029，平滑念珠菌ATCC 22019均由中國國家菌種庫購買。

1.2 供試藥物

伊曲康唑，批號：20111101，成都倍特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，由四川省醫(yī)藥有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)試劑

RPMI-1640液體培養(yǎng)基（GIBCO公司生產(chǎn)，批號31800-022），沙氏培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號20120818），固體瓊脂粉（成都市科龍化工試劑廠，批號20120301），葡萄糖（成都市科龍化工試劑廠，批號20120331）。

1.4 方法

1.4.1 液體培養(yǎng)基稀釋法（微量法）受試菌液的配制 所有受試菌株，均由甘油保存于－20℃。實(shí)驗(yàn)前接種于改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基平皿上復(fù)蘇，于35℃培養(yǎng)7天后，傳代一次受試。取新鮮沙氏培養(yǎng)基上的單一菌落3～5個(gè)，用5mL生理鹽水配置為0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?～5×106CFU﹒mL-1），并用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋1000倍為1～5×103CFU﹒mL-1菌懸液備用。受試藥物配制 采用培養(yǎng)基對倍稀釋方案，將藥物伊曲康唑溶于RPMI-1640液體培養(yǎng)基中，對倍稀釋，使伊曲康唑終濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg﹒mL-1。加藥方案 將受試藥液按濃度差異分別加入U(xiǎn)形96孔板中，每孔加入100 μL藥液。而后加藥孔菌加入對應(yīng)20株不同菌種的100 μL菌懸液，使每孔菌濃度均保持在0.5～2.5×103CFU﹒mL-1。試驗(yàn)結(jié)果判定 96孔板于35℃ 孵育培養(yǎng)48 h后，與空白對照組進(jìn)行比較，以肉眼澄清為標(biāo)準(zhǔn)，以溶液澄清的最低藥物劑量為該藥物對該受試菌的最小抑菌濃度MIC值。質(zhì)控菌白色念珠菌ATCC 90029、平滑念珠菌ATCC 22019跟隨每批實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法

1.4.2.1 受試菌液的配制同液體培養(yǎng)基稀釋法項(xiàng)下加藥方案及結(jié)果判定 將伊曲康唑用無菌水倍比稀釋為10個(gè)濃度，分別精密量取1mL藥液與加熱溶解的14mL含2%葡萄糖的RPMI-1640固體培養(yǎng)基（每L培養(yǎng)基中已經(jīng)加入消毒滅菌的12.5 g固體瓊脂粉，并充分溶解）充分混合，加入到90 mm的一次性消毒培養(yǎng)皿中，保持培養(yǎng)皿中所含抗菌藥的最終稀釋濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg﹒mL-1。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，吸取20株菌株的菌懸液5 μL分別接種于含藥培養(yǎng)皿中，35℃條件下于孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)，以肉眼未見真菌菌團(tuán)生長的最低藥物濃度為 MIC。質(zhì)控菌白色念珠菌ATCC 90029、平滑念珠菌ATCC 22019跟隨每批實(shí)驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

記錄每一株真菌的MIC值，以50%真菌MIC值為MIC50，以90%真菌MIC值為MIC90，以最小MIC值與最大MIC值之間的范圍為MIC range，并比較兩種試驗(yàn)方法下，20株白色念珠菌對伊曲康唑敏感性的差異。

2 結(jié)果

兩種體外抗真菌敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 兩種體外抗真菌敏感性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，兩種方法所測得的MIC具有一致性。

3 討論

隨著社會的發(fā)展以及醫(yī)療水平的提高，移植、腫瘤和免疫缺陷患者的增多，侵襲性真菌感染（Invasive fungal infections ，IFI）病例也明顯增加。近年來有多種新型抗真菌藥物投入臨床，臨床真菌耐藥性也隨之出現(xiàn)?，F(xiàn)已有報(bào)道，有多種中藥及提取物具有抗真菌的作用[4]。說明中藥抗真菌藥物的研發(fā)具有很大的優(yōu)勢和潛力。但是由于中藥單體或復(fù)方的特殊性，如成分復(fù)雜、溶解度差，并且往往帶有較深的顏色，所以傳統(tǒng)的抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)已難以滿足中藥抗真菌藥物的研究。本試驗(yàn)就是在原有的抗真菌試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。此種方法不但可以在短期內(nèi)通過觀測可視菌落的生長判定藥物的MIC值，同時(shí)還避免了由于藥物本身原因造成的肉眼MIC值判定的誤差，具有實(shí)用性。本試驗(yàn)以常用抗真菌藥伊曲康唑?yàn)檩d體，采用兩種方法觀測其近期臨床分離白色念珠菌的藥物敏感性，兩種方法所得結(jié)果具有一致性，結(jié)果初步顯示改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法有可能成為一種評價(jià)抗真菌藥物體外敏感性的一種直觀、簡單、快速的方法。

[1] 劉錦燕.抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,24(12):927.

[2] National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997:1.

[3] 李厚敏,劉偉,李若瑜.美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會2003年版產(chǎn)孢絲狀真菌藥敏試驗(yàn)方案簡介[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(1):121.

[4] 王剛生,鄧潔華.桂皮油藿香油復(fù)合物對曲霉菌活性及機(jī)理的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,23(6):1426.