不同炮制方法對(duì)木瓜中總皂苷溶出的影響

陳秋蘭，廖華衛(wèi)，蘇曉純，王光寧

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實(shí)，習(xí)稱“皺皮木瓜”，味酸、溫，入肝、脾經(jīng)，有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，用于濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋攣痛、腳氣水腫等?；瘜W(xué)成分主要有黃酮類、萜類、有機(jī)酸類、多糖、鞣質(zhì)、果膠等[1]，研究表明皂苷類成分是木瓜保肝、抗炎的有效部位之一[2~3]，炮制對(duì)木瓜中皂苷類成分的影響尚未見報(bào)道，因此本文對(duì)木瓜不同炮制品中總皂苷的含量進(jìn)行比較，分析炮制因素對(duì)總皂苷成分溶出的影響，從而為揭示木瓜炮制機(jī)理做出有益的探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)2450（日本島津公司）、十萬(wàn)分之一電子天平BP211D、HH-6恒溫水浴鍋、DS-8510型超聲波清洗器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 甲醇、乙酸乙酯、石油醚、高氯酸、正丁醇、冰醋酸、香草醛、無(wú)水乙醇均為分析純，黃酒（四川巨龍食品有限公司）為食品級(jí)。

1.2.2 藥材與對(duì)照品 木瓜藥材（購(gòu)于廣州柏盛堂中藥有限公司，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院中藥資源系馬鴻雁博士鑒定為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai干燥近成熟果實(shí)）；齊墩果酸對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110713-200910，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品的制備

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]及各省市炮制規(guī)范整理出常用的五種木瓜飲片。

①生品

取木瓜片，置60 ℃烘箱中干燥1 h，取出，待涼后置干燥器中保存。

②炒黃品

取干燥木瓜片20 g，置炒制容器中，文火加熱，炒至表面微黃，取出放涼，篩去碎屑，待涼后置干燥器中保存。

③炒焦品

取干燥木瓜片20 g，置炒制容器中，文火加熱，炒至表面微焦，取出放涼，篩去碎屑，待涼后置干燥器中保存。

④鹽炙品

取干燥木瓜片20 g，照2010版《中國(guó)藥典》附錄炮制通則[5]，加鹽水拌勻（食鹽用量2%），悶透，置炒制容器內(nèi)，文火加熱，炒至規(guī)定的程度時(shí)，取出，放入60 ℃烘箱烘干，取出，待涼后置干燥器中保存。

⑤酒炙品

取干燥木瓜片20 g，照2010版《中國(guó)藥典》附錄炮制通則[5]，加黃酒（10～20%）拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，文火加熱，炒至規(guī)定的程度時(shí)，取出，放入60 ℃烘箱烘干，取出，待涼后置干燥器中保存。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取105 ℃干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，置10 mL的容量瓶中用無(wú)水乙醇溶解、定容，搖勻，濃度為0.226 mg﹒mL-1，備用。

2.2.2 樣品溶液 取生品及炮制品粉末各10 g，按1∶10石油醚回流脫脂2次，每次1 h。取1 g脫脂后的干燥粉末，精密稱重，置具塞錐形瓶中，加入20 mL75%的乙醇，超聲提取兩次，每次1 h，過(guò)濾，75%乙醇洗滌濾紙和濾渣，合并濾液及洗滌液并減壓濃縮至8 mL左右，加入水飽和的正丁醇萃取至正丁醇相無(wú)色（5×10 mL），合并正丁醇層，用少量水洗滌2次，合并水層并用少量水飽和的正丁醇洗滌1次。將所有的正丁醇萃取液和洗滌液合并，減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 分別吸取0.2 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液置具塞試管中，揮干溶劑，精密加入新配制的5%香草醛-冰乙酸0.2 mL，再加入高氯酸溶液0.8 mL，振搖，在70 ℃水浴中加熱15 min，取出，流水浴中冷卻10 min，加乙酸乙酯4.00 mL，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描(見圖1，圖2)。

圖1 齊墩果酸對(duì)照品圖

圖2 樣品溶液圖

由圖分析可知齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液均在545 nm處有最大吸收，因此測(cè)定波長(zhǎng)選為545 nm。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，置具塞試管中，揮干溶劑，按照2.3.1加入顯色劑，在545 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的濃度（C）為橫坐標(biāo)，求得回歸方程為y=0.0513x－0.0015，R2=0.9996，表明在2～22 μg﹒mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液0.2mL，置具塞試管內(nèi)，揮干溶劑，按照2.3.1加入顯色劑，在545nm處每隔5min測(cè)定一次吸光度。結(jié)果表明，1h內(nèi)的吸光度RSD為1.27%，表明樣品溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液0.2 mL，置具塞試管內(nèi)，揮干溶劑，按照“2.3.1”加入顯色劑，在545 nm連續(xù)測(cè)定六次，記錄吸光度。結(jié)果表明：RSD為0.117%，表明儀器精密度較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份1 g經(jīng)石油醚脫脂后的干燥木瓜粉，精密稱重，置具塞錐形瓶中，按照樣品溶液制備方法提取精制。按照“2.3.1”加入顯色劑在545 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果總皂苷平均含量為0.817%，RSD為1.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品粉末1 g，平行6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照樣品溶液制備方法提取精制。精密吸取六份樣品溶液各0.1 mL，置具塞試管內(nèi)，分別準(zhǔn)確加入0.0226 mg﹒mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL（含齊墩果酸33.9 μg），揮干溶劑，按照“2.3.1”加入顯色劑，在545 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見下表。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.4 樣品含量測(cè)定

取各炮制品粉末1 g，平行3份，按照樣品溶液制備方法提取精制，再分別精密量取各樣品溶液0.2 mL，加入具塞試管中，揮干溶劑，按照“2.3.1”加入顯色劑，在545 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算各樣品中總皂苷的含量，結(jié)果見下表。

表2 木瓜各炮制品中總皂苷含量

3 討論

3.1 顯色條件考察

香草醛-高氯酸是常用的三萜皂苷顯色劑，顯色靈敏度高，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其顯色反應(yīng)的加熱溫度、加熱時(shí)間、加入的顯色劑比例等考察確定5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL、反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min作為木瓜總皂苷比色法測(cè)定的顯色條件。

3.2 含量比較

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，酒炙品、炒黃品和炒焦品中總皂苷的含量均高于生品，且以酒炙品為最高，依次為炒焦品、炒黃品；而鹽炙品中總皂苷的含量明顯低于生品。在本實(shí)驗(yàn)中影響皂苷類成分溶出的炮制影響因素主要有溫度、時(shí)間和輔料，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，溫度和時(shí)間會(huì)有利于皂苷類成分的溶出，輔料酒是良好的溶媒，也有利于皂苷類成分的溶出，因此酒炙品中總皂苷含量最高。關(guān)于鹽炙品中皂苷含量為何較低，輔料食鹽在溶出過(guò)程是否有影響還有待于進(jìn)一步研究。

[1] 吳虹,魏偉,吳成義.木瓜的化學(xué)成分及藥理活性的研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,23(2):62.

[2] 戴敏,魏偉,汪倪萍.木瓜苷對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003,19(3):340.

[3] 吳虹,戴敏,魏偉,等.木瓜中不同提取物的藥效學(xué)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2004,11(2):98.

[4] 胡居杰,汪電雷.木瓜炮制歷史沿革[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,19(6):42.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:402.