崔 彬，馮靜弦，胡 琪，饒力群

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128）

黃酮類化合物是植物代謝過程中產(chǎn)生的一類重要天然有機化合物，廣泛存在于自然界的植物中，屬植物次生代謝產(chǎn)物，近年來一直是國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點[1]。黃酮類化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核的一類衍生物[2]。它在植物界分布很廣，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在，也有的以游離形式存在。黃酮類化合物具有抗抑郁，抗氧化與消除自由基活性的作用，近年來被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[3]。

目前我國對羅漢果的廣泛使用主要在于提取甜苷，但其中黃酮類化合物含量也很高[4]。陳全斌等[5]利用反相高效液相色譜法，證實了羅漢果中含有黃酮苷元山奈酚，并首次發(fā)現(xiàn)含有黃酮苷元槲皮素，測得羅漢果鮮果中總黃酮含量5～10 mg/個，甜苷中總黃酮含量為1.42%。所以開發(fā)利用羅漢果黃酮有實際意義。

響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝的有效方法，是利用合理的試驗設(shè)計采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的一種實驗設(shè)計方法和數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法[6-7]。近年來，響應(yīng)面分析法已越來越多地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。本文以羅漢果黃酮的得率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對羅漢果黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝，以提高羅漢果黃酮的提取效率，得到高純度的黃酮產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原 料 羅漢果果實購于長沙市高橋批發(fā)市場，剝殼，粉碎，備用。

1.1.2 試 劑 無水乙醇、超純水、氫氧化鈉（AR），天津市大茂化學試劑廠；亞硝酸鈉（AR），湖南匯虹試劑廠；硝酸鋁（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；回流提取儀和ALZ04電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FW177中草藥粉碎機，天津泰斯特；紫外-可見分光光度檢測器，Agilent1100。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅漢果黃酮的提取 精確稱取5 g羅漢果粉末于圓底燒瓶中，加入一定量一定濃度的乙醇，在一定溫度下浸提一定時間，提取液抽濾，濃縮回收乙醇，得粗提液。

1.2.2 標準曲線的測定 精密吸取標準蘆丁溶液1、2、3、4、5 mL，分別置于 10 mL 刻度試管中，精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，最后用30%乙醇定容至10 mL，搖勻后放置15 min，置于比色皿中，在500 nm處測定吸光度，標準曲線的回歸方程為：y=1.284 x+0.143（R2=0.994 7）

1.2.3 測定方法 精密吸取提取液1 mL置于10 mL刻度試管中，按照1.2.2中的方法測定吸光度。用以下公式計算得率：e=Y×n×V/W×100%，其中Y為黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL），V為原提取液體積（mL），W為羅漢果樣品質(zhì)量（mg），n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken方法，選取主要影響因素為自變量，得率（%）為響應(yīng)值。通過響應(yīng)曲面進行羅漢果黃酮提取工藝的優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

按1.2.1方法，選擇乙醇濃度，提取時間，料液比，提取溫度為單因素，考察不同條件對提取效果的影響。結(jié)果如圖1～4。

圖1 乙醇濃度對得率的影響

圖2 提取時間對得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化羅漢果黃酮的提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分數(shù)，提取溫度，提取時間3個因素的合適水平，對提取工藝進行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，因素水平設(shè)置見表1。

圖3 料液比對得率的影響

圖4 提取溫度對得率的影響

表1 響應(yīng)面中心組合試驗因素與水平

對羅漢果黃酮提取工藝進行響應(yīng)面分析，具體試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

2.2.1 方差分析和二次回歸方程擬合 利用Design Expert軟件對試驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合，得到以羅漢果黃酮得率為響應(yīng)值，與編碼自變量 X1，X2，X3的二次多項回歸方程：

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察（表3）。結(jié)果表明，模型擬合度高，p<0.05，回歸模型的決定系數(shù)為0.956 5。失擬的Pr＞F值為0.056 2，是不顯著的，說明數(shù)據(jù)擬合效果較好，能夠很好地描述試驗結(jié)果。因此，可以用此模型對羅漢果黃酮得率進行分析和預(yù)測。由表3中的F值檢驗可以得到因子貢獻率為X1>X2>X3，即乙醇濃度>提取溫度>提取時間。

表3 響應(yīng)面分析方案與試驗結(jié)果

2.2.2 交互作用分析 各因素X1、X2、X3對響應(yīng)值得率所構(gòu)成的三位空間的曲面圖，可反映各因素對其響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖可較為直觀地看出各因素對得率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對得率的影響越大，由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。圖5～7表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對羅漢果黃酮得率的影響以乙醇濃度（X1）最大，提取溫度次之（X2），提取時間（X3）的影響最小。這也符合表3的方差分析結(jié)果。

圖5 乙醇濃度和提取溫度對羅漢果黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 乙醇濃度和提取時間對羅漢果黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7 提取溫度和提取時間對羅漢果黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.3 驗證試驗 在軟件給出的處理方案中，本試驗選擇的最佳工藝條件為乙醇濃度76.59%，提取溫度84.29℃，提取時間0.76 h時，預(yù)測得率最優(yōu)值為1.573%。根據(jù)選擇的最佳工藝，調(diào)整羅漢果黃酮提取的工藝條件為乙醇濃度77%、提取溫度85℃、提取時間48 min，進行驗證試驗，3次平行試驗得到羅漢果黃酮提取液實際得率為1.538%。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析方法是研究集中因素間交互作用的回歸分析方法，用該方法研究羅漢果黃酮提取工藝參數(shù)，求得的回歸方程精度高，可以準確找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。該方法通過響應(yīng)面圖直觀分析了各因素對羅漢果黃酮得率的影響，以及各因素之間對提取過程的交互影響。

通過Design-Expert7.0軟件采用Box-Behnken實驗設(shè)計對羅漢果黃酮提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到了最佳提取工藝，結(jié)合生產(chǎn)實際，可調(diào)整羅漢果黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇濃度77%、提取溫度85℃、提取時間48 min，驗證試驗的實際得率為1.538%，與理論值接近，說明響應(yīng)值的試驗值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，優(yōu)化結(jié)果可信，具有實用價值。

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