狹葉薰衣草離體培養(yǎng)技術(shù)研究

王 嬋，陳麗娟，程明華，方頌娟，但 敏，李妮亞

（海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158）

狹葉薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）為唇形科薰衣草屬多年生亞灌木[1].狹葉薰衣草的香氣尤為宜人，也是經(jīng)濟(jì)價值最好的薰衣草.狹葉薰衣草喜冷涼全日照的環(huán)境，不宜在高溫潮濕環(huán)境中生長[2-4]，目前大面積的種植主要是在新疆伊犁，種植面積占全國薰衣草種植面積的95%左右[5].由于狹葉薰衣草種子發(fā)芽率低，且出苗很不一致，要達(dá)到60%～70%的出苗率，需2至3個月的時間.劉珊等[6]報道，以幼嫩的英國薰衣草葉片，通過愈傷再分化，得到完整植株.蘇秀娟等[7]以英國薰衣草葉片為外植體，分化出芽獲得再生植株，表明可以通過組織培養(yǎng)，大量快繁英國薰衣草.植物的離體培養(yǎng)再生技術(shù)，主要具有兩個方面的優(yōu)點(diǎn)：首先是利用該技術(shù)進(jìn)行植物的快繁并且可研究植物器官的發(fā)生；第二為植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體細(xì)胞誘變育種提供了較好的材料.本實(shí)驗(yàn)以狹葉薰衣草為材料，誘導(dǎo)狹葉薰衣草葉、莖段和頂芽的愈傷組織，并通過帶有葉的頂芽不經(jīng)愈傷直接分化出芽而獲得再生植株.使得含高品質(zhì)精油的狹葉薰衣草能快速大量繁殖，同時為下一步通過化學(xué)誘變和組織培養(yǎng)相結(jié)合的方法培育狹葉薰衣草新品種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：狹葉薰衣草種子（購于中國香草種子銷售中心）在本實(shí)驗(yàn)室常溫下培育成幼苗；選用長勢好、無病蟲害、伸展的狹葉薰衣草葉和頂芽作為外植體.

試劑：MS（Murashige and Skoog培養(yǎng)基）；6-BA（6-芐氨基嘌呤）；NAA（萘乙酸）；2.4-D（2.4-二氯苯氧乙酸）；IBA（吲哚丁酸）.

1.2 方法

1.2.1 消毒

將狹葉薰衣草葉片、嫩莖和頂芽剪下，流水沖洗1.5～2.0 h.在無菌室工作臺上將外植體先用75%的酒精浸泡30 s后無菌水沖洗3～5遍，再用0.1%的升汞溶液清洗2 min后無菌水沖洗3～5遍，然后用無菌濾紙吸干葉片表面水分.

1.2.2 培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，按不同的實(shí)驗(yàn)要求配制培養(yǎng)基（蔗糖：3%；瓊脂：0.7%；pH：5.8）：①M(fèi)S+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L；②MS+2,4-D 0.1mg/L+6-BA 0.3mg/L；③MS+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.3 mg/L；④MS+6-BA 1.0mg/L；⑤MS+6-BA 2.0mg/L；⑥ MS+6-BA 0.1mg/L；⑦M(jìn)S+6-BA 0.5mg/L；⑧1/2MS+IBA 0.5mg/L；⑨1/2MS+NAA 0.5mg/L.

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

將無菌的外植體頂芽、莖段、葉片接種到培養(yǎng)基①、②和③上.每瓶1～2個外植體，把葉片邊緣切除或用無菌刀從葉片中間輕輕劃1～2下，利于發(fā)生愈傷.在23±1℃，8 h光照（光照強(qiáng)度為1 500 lx），16 h暗培養(yǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.4 愈傷組織的繼代

將在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長1個月的愈傷組織，挑淡黃色、疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)接到④和⑤上，每組20個重復(fù).

1.2.5 叢生芽的誘導(dǎo)

取幼嫩頂芽為外植體，保留頂芽2～3個葉片和其下0.5～1.0 cm左右的莖段，經(jīng)消毒后接種到⑥MS+6-BA 0.1 mg/L上.薰衣草葉片幼嫩，消毒時間不宜超出3min，防止消毒劑對外植體組織的傷害.外植體流水沖洗2 h左右后葉片張力明顯增加，可在消毒時滴加1～2滴吐溫80溶液，以消除葉片表面張力使葉片易于貼附在培養(yǎng)基上.

1.2.6 芽的繼代增殖培養(yǎng)

芽的繼代增殖培養(yǎng)，主要參考Hu等[8]人的方式進(jìn)行.取1.0～1.5 cm單芽轉(zhuǎn)移到芽繼代培養(yǎng)基（⑦M(jìn)S+0.5mg/L 6-BA）上培養(yǎng)，每瓶接1～2個芽，20～25 d后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)接，這樣可以得到大量的叢生芽.轉(zhuǎn)接2-3代后，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得完整的狹葉薰衣草植株.

1.2.7 再生芽的生根培養(yǎng)

將幼嫩叢生芽切分開接種到⑧1/2MS+IBA 0.5mg/L和⑨1/2MS+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上，每皿接1～2個小芽塊，設(shè)5個重復(fù)，于人工氣候箱先暗培養(yǎng)1周，然后移入光照培養(yǎng)，觀察生根情況并及時記錄初生根時間、生根條數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對愈傷誘導(dǎo)及增殖的影響

接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的外植體，一周后在葉片、莖段和頂芽的切口處有膨大的現(xiàn)象，15 d后相繼長出稍許白色愈傷.40 d后統(tǒng)計愈傷組織發(fā)生情況.

表1 不同植物激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 The effect of different concentration of hormones on callus on leaf of L.angustifolia

表1表明，以培養(yǎng)基①誘導(dǎo)愈傷效果好，達(dá)62.5%，當(dāng)把初次發(fā)生的愈傷轉(zhuǎn)接到6-BA 1.0mg/L和6-BA 2.0mg/L后，愈傷增殖效果都非常好，其愈傷增殖率差別不甚明顯，都達(dá)100%，且長勢優(yōu)良而迅速，25～30 d愈傷更加透亮，可長滿整個培養(yǎng)瓶.此外，組織褐化現(xiàn)象很容易出現(xiàn)，尤其是葉片，接種后5～7 d即開始褐化并逐漸褐化加深.而低濃度的2,4-D（0.1和0.2 mg/L）和低濃度的6-BA（0.3 mg/L）配比，出愈率都較低.劉珊等[6]實(shí)驗(yàn)表明，2,4-D濃度高于0.1 mg/L時的12個組合激素配比，外植體的出愈率都低于60%，2,4-D濃度為0.1 mg/L時外植體出愈率都高于70%，劉珊等[6]采用是較高濃度的KT和較低濃度2,4-D配比.這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，推測是在高濃度2,4-D，同時加入高濃度的6-BA，可較快的誘導(dǎo)狹葉薰衣草愈傷的發(fā)生.張艷玲等[9]報道，6-BA濃度高的配比比6-BA濃度低的配比愈傷數(shù)發(fā)生的多.

2.2 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別取外植體葉片、莖段和頂芽接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，一周后葉片的切口處、葉柄基部、莖段端部和頂芽有膨大現(xiàn)象，20 d后部分葉片較易因褐化而停止發(fā)生愈傷，莖段和頂芽褐化不明顯，能繼續(xù)生長出愈傷.

2.3 以帶葉頂芽為外植體誘導(dǎo)芽的分化和芽擴(kuò)增

取帶葉頂芽為外植體，且保留其下部0.5～1.0 cm左右的莖部，消毒后將其接種到⑥MS+6-BA 0.1mg/L上，2周后莖基部出現(xiàn)小部分愈傷，25 d后出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)并開始逐漸分化成叢生芽，出芽率達(dá)80%，35 d后芽增長較快，取基部約1 cm切段轉(zhuǎn)移到叢生芽繼代培養(yǎng)基（⑦M(jìn)S+0.5mg/L 6-BA）上，培養(yǎng)15～20 d，逐漸有許多小芽從基部生出形成叢生芽.且在叢生芽上不斷有新的頂芽和腋芽冒出，培養(yǎng)基因芽體的生長顯著減少.留出一部分小芽繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，其余的小芽用于生根培養(yǎng).

2.4 再生植株的生根培養(yǎng)

將芽叢中長至1～2 cm的單芽切下后，分別接種到⑧1/2MS+IBA 0.5mg/L和⑨1/2MS+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上.在含有IBA 0.5mg/L培養(yǎng)基中的叢生芽的芽體，5～7 d后頂芽基部莖段端膨大并裂開，10 d后裂開處冒出3～4個2 mm左右的根，20 d已有明顯可見的根長出，而接種1/2MS+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上叢生芽的芽體，未能長出根.

3 討論

在薰衣草組織培養(yǎng)中，以葉片、莖段和頂芽為外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖，頂芽誘導(dǎo)愈傷的效果最好，莖段和葉片次之.接種10 d后葉邊緣、柄基部、莖段兩端膨大明顯，可見乳白色愈傷出現(xiàn)，但外植體褐化嚴(yán)重，葉片尤其易褐化發(fā)黑，達(dá)70%.因此開始培養(yǎng)的一周內(nèi)光強(qiáng)度稍減弱，而且在相同成分培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接1～2次，減小褐化率，30～35 d左右愈傷長勢良好.張艷玲等[9]以孟士德薰衣草（Lavandula angustifolia‘Munstead’）葉片研究表明：以葉片為外植體全部褐化死亡，而Tsuro等[10]以薰衣草（Lavandula vela）子葉誘導(dǎo)愈傷組織獲得較好的效果，這可能是由于子葉較葉片生長時間短，含精油量少，不宜褐化.或者，不同植物材料褐化程度也不一樣[9].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：接種在同樣的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的莖段和頂芽均能進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，無褐化現(xiàn)象，這與張艷玲等[9]人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.這可能與莖段和頂芽內(nèi)酚類物質(zhì)少或氧化酶活性低有關(guān).以MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 2.0mg/L植物激素配比，出愈率較高.這與一些學(xué)者的結(jié)果相似.Calvo等[11]報道6-BA濃度以2.0 mg/L對愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽分化的效果最好.但也有報道[12]，以2,4-D誘導(dǎo)薰衣草（Lavandula angustifolia）愈傷，再加6-BA，出芽困難，本實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)果.而劉珊等[6]以KT代替6-BA，也已獲得較好的薰衣草芽分化.

用MS+6-BA 0.1mg/L培養(yǎng)基上以芽誘導(dǎo)腋芽，用MS+6-BA 0.5mg/L培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的叢生芽，在短時間內(nèi)得到大量的有效芽，將這些芽用于生根培養(yǎng)，生根率達(dá)75%，得到狹葉薰衣草再生植株.

在狹葉薰衣草帶葉頂芽離體培養(yǎng)中，由于外植體較大，很易污染，采用葉片消毒時，先用流水沖洗1.5～2.0 h，接種前再用0.1%升汞浸泡2 min時間，得到較好的效果，大大降低了污染.外植體消毒時間的長短，直接影響了組織培養(yǎng)的成功與失敗，尤其對較幼嫩薰衣草的葉片，一定要掌握好葉片消毒的時間和方式[7].

已有文獻(xiàn)報道[7，13]，在生根培養(yǎng)中，一定范圍內(nèi)IAA濃度增加對根誘導(dǎo)和生長有增強(qiáng)的趨勢.我們的實(shí)驗(yàn)采用了1/2MS+IBA 0.5mg/L，生根效果較好，而用1/2MS+NAA 0.5mg/L，未能誘導(dǎo)出根，但許耀祖等[12]利用MS+IAA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖15 g/L+活性炭1.0 g/L，做為1種宜于薰衣草生根的理想培養(yǎng)基，這可能與不同品種和所用外植體不同有關(guān).再者，生長素對根、莖、葉的生長的影響以根最為敏感，薰衣草幼苗本身能夠產(chǎn)生較多的生長素，故誘導(dǎo)生根僅需要很低濃度的生長素[7].表明單獨(dú)用較高濃度NAA不利誘導(dǎo)生根培養(yǎng).

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