轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的影響

宋亞娜，蘇 軍，林 艷，王 鋒

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003

土壤氮素生物地球化學(xué)循環(huán)是土壤物質(zhì)能量循環(huán)的重要組成部分，它能夠影響土壤質(zhì)量、氮素的植物吸收利用及農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力、可持續(xù)性及環(huán)境變化。硝化作用是土壤氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)土壤氮素養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化具有重要意義。氨氧化細(xì)菌是執(zhí)行硝化作用第一步的關(guān)鍵微生物，即將氨氧化為亞硝酸鹽，該步驟也是硝化速率的限制性環(huán)節(jié)(Phillips et al.，2000)。雖然在水稻淹水時(shí)土壤處于厭氧條件而抑制硝化作用，但由于水稻根系能夠分泌O2，為水稻根表和根際提供了充足的氧，足以支持非專一性的好氧微生物過(guò)程，而使水稻根際具有顯著硝化作用的可能(Brune et al.，2000)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，稻田土壤中不僅存在豐富的氨氧化微生物基因資源，而且其群落組成和豐度變化活躍。土壤類型、水稻品種、施肥及土壤pH等環(huán)境因素均可改變氨氧化細(xì)菌的群落組成或豐度(宋亞娜等，2009;鐘文輝等，2008;He et al.，2007;Nicol et al.，2008;Shen et al.，2008)。

在轉(zhuǎn)基因水稻栽培中引入外源基因，有可能改變轉(zhuǎn)基因作物的根系分泌物、根系及植株殘?bào)w的組成及其降解過(guò)程，從而影響土壤物質(zhì)能量的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程，改變土壤微生物組成及土壤中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化循環(huán)(Masoero et al.，1999;Poerschmann et al.，2005、2008、2009;Saxena ＆ Stotzky，2001)。目前，已有研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因水稻秸稈的降解對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落沒有影響(Lu et al.，2010a、2010b;Wu et al.，2004)。但有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的功能微生物(如氨氧化細(xì)菌)群落結(jié)構(gòu)的影響還未見報(bào)道。

本研究通過(guò)3～4年的田間定位試驗(yàn)研究連續(xù)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻后土壤氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的變化，旨在為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻種植的土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻是由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)(GM)和非轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)明恢86(CK)。以三系水稻恢復(fù)系明恢86為受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙T-抗蟲PCDMARUBAC載體中的cry1Ac(蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因)和cpti(修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)2個(gè)抗蟲基因?qū)胨荆@得能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系科豐8號(hào)。以科豐8號(hào)的T8代純合株系為父本、Ⅱ-32A為母本配制成轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)。以轉(zhuǎn)基因水稻科豐8號(hào)的受體恢復(fù)系明恢86為父本、Ⅱ-32A為母本配制獲得非轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)明恢86。轉(zhuǎn)基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)于2006年獲得農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)性試驗(yàn)。

1.2 定位試驗(yàn)

2008年開始在具有防護(hù)措施的聯(lián)動(dòng)網(wǎng)室中建立水稻定位試驗(yàn)。地點(diǎn)位于福建省福州市郊的“吳鳳水稻試驗(yàn)基地”(26°01' 北緯、119°20'東經(jīng))。該試驗(yàn)基地屬暖濕亞熱帶季風(fēng)氣候，年無(wú)霜期長(zhǎng)達(dá)326 d，年均氣溫19.6℃，平均濕度77%，年均降水量1342.5 mm。供試土壤為砂壤，土壤有機(jī)質(zhì)含量為 23.32 g·kg－1，pH 6.15，全氮 1.65 g·kg－1，全磷(P2O5)0.76 g·kg－1，全鉀(K2O)18.28 g·kg－1，速效氮 154.53 mg·kg－1，速效磷 31.34 mg·kg－1，速效鉀 70.52 mg·kg－1。

于2008、2009、2010和2011年連續(xù)4年種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因抗蟲水稻。挑選飽滿的水稻種子于30℃催芽2 d，選發(fā)芽勢(shì)強(qiáng)、整齊一致的種子播種，1個(gè)月后插秧，株行距為20 cm×20 cm，單本插。4年均作中稻栽培，5月播種，6月插秧，10月收獲。前一年收獲后留茬10 cm割稻，稻茬留田自然越冬。次年春季將稻茬翻入土中，于6月繼續(xù)按前一年的小區(qū)排列方式種植。每種材料設(shè)3次重復(fù)，6個(gè)小區(qū)隨機(jī)排列，每個(gè)小區(qū)種植水稻350株。定位試驗(yàn)期間除不使用殺蟲劑外，水肥和田間管理措施等均按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)。

1.3 樣品采集

分別于2010(定位試驗(yàn)第3年)和2011年(定位試驗(yàn)第4年)水稻分蘗期(播種后60 d)、齊穗期(播種后90 d)及成熟期(播種后120 d)采集土壤樣品。采用五點(diǎn)取樣法，每次重復(fù)取5株水稻，將水稻整株挖起后取根系周圍分布密集的土層深度為10～20 cm的土壤，將5株水稻根系土壤混合為1個(gè)土樣，放入4℃冰盒中保存。于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)去除土樣根系、雜草和石塊等雜質(zhì)后混勻，分裝入50 mL塑料離心管中，－20℃保存以用于土壤微生物分析。

1.4 分析方法

1.4.1 土壤微生物總DNA提取 稱取0.5 g于－20℃保存的土壤樣品，采用FastDNA?SPIN Kit For Soil(Q BIOgene)試劑盒進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，將DNA樣品于－20℃冰箱保存待用。

1.4.2 聚合酶鏈反應(yīng)—變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)分析 利用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因特異引物(Song et al.，2007)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(表 1)，檢測(cè)氨氧化細(xì)菌群落組成。反應(yīng)體系50 μL，其中，2 μL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液48 μL，反應(yīng)液包括1 μL Taq DNA 聚合酶(2.5 U· L－1，天根生物公司，北京)，5 μL dNTPs(2 mmol·L－1各堿基，上海生物工程公司)，5 μL 10×PCR-buffer(10倍 PCR緩沖液，天根生物公司，北京)，前、后引物各4 μL(5 pmol· L－1，上海英駿生物工程公司)和 29 μL超純水。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳EB(溴化乙錠)染色檢查后，用40 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，采用梯度為35%～50%的8%聚丙烯酰胺凝膠［化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol·L－1和40%(v/v)去離子甲酰胺］在1倍TAE緩沖液中于150 V、60℃下電泳5 h。電泳后用10 mL SYBR green I(Sigma)(1倍 TAE稀釋10000倍)核酸染料染色45 min，然后用Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。

表1 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件Table 1 Primers and PCR conditions used for the study

1.4.3 氨氧化細(xì)菌的豐度檢測(cè) 以土壤中氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)表示氨氧化細(xì)菌豐度。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)稻田土壤中氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)量。如表1所示，氨氧化細(xì)菌的熒光定量PCR擴(kuò)增采用16S rRNA基因特異引物，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。采用SYBR?Premix Ex TaqTM(TakaRa，大連)試劑盒于ABI PRISM7500 Real-Time PCR System擴(kuò)增儀上進(jìn)行絕對(duì)定量PCR分析。熒光定量 PCR反應(yīng)體系25 μL，其中，2 μL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液23 μL，反應(yīng)液包括12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(× 2)，0.5 μL ROX Reference DyeⅡ (×50)，前、后引物各 1 μL(5 pmol· L－1)和8 μL 超純水。

1.4.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以非轉(zhuǎn)基因水稻土樣提取的DNA為模板進(jìn)行氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增(表1)。將100 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的基因的片段約 465 bp，用 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(OMEGA，美國(guó))膠回收試劑盒純化。按照試劑盒方法用pMD18-T載體連接PCR產(chǎn)物，以大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆。取部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌液送上海英駿生物工程有限公司測(cè)序，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank Blast比對(duì)，與氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因(EU127347)同源性達(dá)99%。這表明重組質(zhì)?？梢宰鳛榘毖趸?xì)菌進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)DNA。利用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，然后用 Nanodrop(Gene Co.Ltd.，美國(guó))測(cè)定重組質(zhì)粒DNA 的質(zhì)量濃度，為99.0 ng·L－1。根據(jù)已知重組質(zhì)粒全序列和阿伏伽德羅常數(shù)［6.02×1023(分子數(shù))·moL－1］計(jì)算氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)，為5.86 ×1010(cells)·μL－1。以 10 倍梯度稀釋氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因重組質(zhì)粒以進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次，獲得氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity One(Bio-Rad)軟件對(duì)DGGE圖譜中DNA條帶的位置和亮度進(jìn)行數(shù)字化;利用CANOCO 4.0(Microcomputer Power，Ithaca，USA)軟件，根據(jù)不同處理DGGE結(jié)果的條帶亮度和位置的數(shù)字化數(shù)值，以不同水稻材料及其生育期為環(huán)境因素對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行冗余分析(redundancy discriminate analysis，RDA)(Marschner et al.，2002)。利用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的影響

利用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因特異引物對(duì)稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成進(jìn)行PCR-DGGE分析(圖1)。由DGGE圖譜可見，無(wú)論在定位試驗(yàn)第3年(圖1A)還是第4年(圖1B)，稻田土壤中都存在豐富的氨氧化細(xì)菌基因，各個(gè)樣品均呈現(xiàn)較多的DGGE條帶。不同DGGE條帶代表土壤中不同種類的氨氧化細(xì)菌，條帶亮度表示在本研究的PCR試驗(yàn)條件下各類氨氧化細(xì)菌的相對(duì)豐度。

依據(jù)DGGE圖譜的條帶位置和亮度的數(shù)字化數(shù)值計(jì)算氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Shannonwiener index)，結(jié)果如表2所示。在定位試驗(yàn)第3、4年，水稻各生育期內(nèi)GM和CK的氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)均沒有顯著差異。這表明種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻不會(huì)改變稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落多樣性。另外，同一種水稻的氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)在水稻不同生育期間的差異也不顯著。

由圖2可見，在定位試驗(yàn)第3、4年，變異較大的x軸方向上的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布差異主要表現(xiàn)在不同水稻生育期間，而同一生育期內(nèi)不同水稻材料的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布較為接近。同時(shí)，經(jīng)RDA顯著性相關(guān)分析也顯示，這2年的土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的變化只與水稻生育期存在顯著相關(guān)性，顯著性水平分別為0.002和0.018。這表明稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成隨水稻生長(zhǎng)而發(fā)生變化，但種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落組成沒有明顯影響。

圖1 定位試驗(yàn)第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的DGGE圖譜Fig.1 DGGE images of community composition of ammoniaoxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

2.2 轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌群落豐度的影響

利用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA建立了絕對(duì)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 3)。其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的 R2為 0.99，斜率為 3.05，線性范圍達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)，為5.86×103～5.86×107(cells)·μL－1。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用熒光定量PCR檢測(cè)到不同處理的土壤氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為1.66 ×106～1.85 ×107(copies)·g－1(干土)。在定位試驗(yàn)第3、4年，土壤氨氧化細(xì)菌的豐度在水稻生長(zhǎng)前期均隨水稻生長(zhǎng)而增大，至水稻齊穗期時(shí)達(dá)到最大，之后逐漸減小(圖4)，GM和CK的氨氧化細(xì)菌豐度在齊穗期時(shí)均顯著高于分蘗期(P＜0.05);但在水稻生長(zhǎng)過(guò)程中，氨氧化細(xì)菌豐度在GM和CK處理間的差異均未達(dá)到顯著性水平(P＞0.05)。由此可見，稻田土壤氨氧化細(xì)菌豐度受水稻生育期的影響較大，而轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌豐度沒有明顯影響。

表2 定位試驗(yàn)第3、4年稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 The diversity of the ammonia-oxidizing bacterial community，characterised by the Shannon index of diversity，in the third and fourth year after establishment of the experimental field site

圖2 定位試驗(yàn)第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細(xì)菌群落組成的冗余分析Fig.2 RDA of the community composition of ammonia-oxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

圖3 氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因絕對(duì)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of real-time PCR of 16S rRNA gene of ammonia-oxidizing bacteria

圖4 定位試驗(yàn)第3年(A)和第4年(B)稻田土壤氨氧化細(xì)菌的豐度Fig.4 Abundance of ammonia-oxidizing bacteria in paddy field in the third(A)and fourth(B)year after establishment of the experimental field site

3 討論

目前，關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境微生物影響的研究結(jié)果因作物種類、目標(biāo)基因、微生物種類等不同而存在差異。在對(duì)轉(zhuǎn)抗病基因木瓜的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因品種的種植能夠改變土壤真菌或細(xì)菌的群落組成(Wei et al.，2006)。而利用磷脂脂肪酸分析方法研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米間沒有顯著差異(Griffiths et al.，2005)。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的秸稈或根系還田對(duì)土壤細(xì)菌或真菌的群落組成也沒有明顯影響(Lu et al.，2010a、2010b)。轉(zhuǎn) Bt基因作物對(duì)土壤微生物沒有影響可能是由于Bt蛋白在土壤中可快 速 降 解 (Daudu et al.，2009;Wang et al.，2006)。

現(xiàn)有的關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻對(duì)環(huán)境微生物群落影響的研究多集中于土壤總微生物如細(xì)菌或真菌的群落方面，而對(duì)一些與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化更為密切相關(guān)的功能微生物的研究較少。本研究通過(guò)田間定位試驗(yàn)分析了轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因雜交稻Ⅱ優(yōu)科豐8號(hào)連續(xù)種植第3、4年，對(duì)與土壤氮素轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的影響。結(jié)果表明，土壤氨氧化細(xì)菌的群落組成和豐度均只與水稻的生長(zhǎng)發(fā)育期相關(guān)，而在轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻間沒有顯著差異?？梢?，田間種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌多樣性沒有明顯影響。

同時(shí)，本研究采用了PCR-DGGE和熒光定量PCR分子生物學(xué)方法。由于土壤中大部分微生物是不可培養(yǎng)的，用常規(guī)的培養(yǎng)方法研究土壤微生物群落的局限性很大。而以 DNA為基礎(chǔ)的PCRDGGE方法能夠較全面地反映土壤微生物組成，熒光定量PCR方法更可準(zhǔn)確檢測(cè)土壤微生物的豐度。另外，本研究通過(guò)連續(xù)4年的田間定位試驗(yàn)，所得結(jié)果能更好地反映種植轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)土壤微生物的影響。本研究證明，在一定時(shí)期內(nèi)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti抗蟲基因水稻不會(huì)產(chǎn)生影響土壤氨氧化細(xì)菌群落組成和豐度的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

此外，由于土壤中微生物種類繁多、數(shù)量龐大等多樣性特征有利于保證其群落的相對(duì)穩(wěn)定，使得轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)土壤微生物多樣性的干擾可能在一定時(shí)期內(nèi)不會(huì)表現(xiàn)。因此仍需要通過(guò)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)進(jìn)一步監(jiān)測(cè)種植轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti基因水稻對(duì)土壤各類微生物多樣性及其生態(tài)功能的影響，從而綜合評(píng)價(jià)種植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性。

宋亞娜，林智敏，林捷.2009.不同品種水稻土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)組成.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，17(6):1121－1125.

鐘文輝，蔡祖聰，尹力初，張鶴.2008.種植水稻和長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥對(duì)紅壤氨氧化細(xì)菌多樣性和硝化作用的影響.土壤學(xué)報(bào)，45(1):105－111.

Brune A，F(xiàn)renzel P and Cypionka H.2000.Life at the oxicanoxic interface:microbial activities and adaptations.FEMS Microbiology Reviews，24:691 －710.

Daudu C K，Muchaonyerwa P and Mnkeni P N S.2009.Litterbag decomposition of genetically modified maize residues and their constituent Bacillus thuringiensis protein(Cry1Ab)under field conditions in the central region of the Eastern Cape，South Africa.Agriculture，Ecosystems ＆ Environment，134:153－158.

Griffiths B S，Caul S，Thompson J，Birch A N E，Scrimgeour C，Andersen M N，Cortet J，Messean A，Sausse C，Lacroix B and Krogh P H.2005.A comparison of soil microbial community structure，protozoa and nematodes in field plots of conventional and genetically modified maize expressing the Bacillus thuringiens is Cry1Ab toxin.Plant and Soil，275:135－146.

He J Z，Shen J P，Zhang L M，Zhu Y G，Xu M G and Di H.2007.Quantitative analyses of the abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea of a Chinese upland red soil under long-term fertilization practices.Environmental Microbiology，9(9):2364 －2374.

Lu H，Wu W，Chen Y，Wang H，Devare M and Thies J E.2010a.Soil microbial community responses to GM transgenic rice residue decomposition in a paddy field.Journal of Soils and Sediments，10:1598 －1605.

Lu H，Wu W，Chen Y，Zhang X，Devare M and Thies J E.2010b.Decomposition of GM transgenic rice residues and response of soil microbial community in rapeseed-rice cropping system.Plant and Soil，336:279－290.

Marschner P，Neumann G，Kania A，Weiskopf L and Lieberei R.2002.Spatial and temporal dynamics of the microbial community structure in the rhizosphere of cluster roots of white lupin(Lupinus albus L.).Plant and Soil，246:167－174.

Masoero F，Moschini M，Rossi F，Prandini A and Pietri A.1999.Nutritive value，mycotoxin contamination and in vitro rumen fermentation of normal and genetically modified corn(cry1Ab)grown in northern Italy.Maydica，44(3):205 －209.

Nicol G W，Leininger S，Schleper C and Prosser J I.2008.The influence of soil pH on the diversity，abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria.Environmental Microbiology，10:2966－2978.

Phillips C J，Harris D，Dollhopf S L，Gross K L，Prosser J I and Paul E A.2000.Effects of agronomic treatments on structure and function of ammonia-oxidizing communities.Applied and Environmental Microbiology，66:5410－5418.

Poerschmann J，Gathmann A，Augustin J，Langer U and Górecki T.2005.Molecular composition of leaves and stems of genetically modified GM and near-isogenic non-GM maize—characterization of lignin patterns.Journal of Environmental Quality，34(5):1508－1518.

Poerschmann J，Rauschen S，Langer U，Augustin J and Górecki T.2008.Molecular level lignin patterns of genetically modified GM-maize MON88017 and three conventional varieties using tetramethylammonium hydroxide(TMAH)-induced thermochemolysis.Journal of Agricultural and Food Chemistry，56(24):11906 －11913.

Poerschmann J，Rauschen S，Langer U，Augustin J and Górecki T.2009.Fatty acid patterns of genetically modified Cry3Bb1 expressing GM-maize MON88017 and its near-isogenic line.Journal of Agricultural and Food Chemistry，57(1):127－132.

Saxena D and Stotzky G.2001.GM corn has a higher lignin content than non-GM corn.American Journal of Botany，88:1704－1706.

Shen J P，Zhang L M，Zhu Y G，Zhang J P and He J Z.2008.Abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea communities.Environmental Microbiology，10:1601－1611.

Song Y N，Mrschner P，Li L，Bao X G，Sun J H and Zhang F S.2007.Community composition of ammonia-oxidizing bacteria in the rhizosphere of intercropped wheat(Triticum aestivum L.)，maize(Zea mays L.)and faba bean(Vicia faba L.).Biology and Fertility of Soils，44(2):307 －314.

Wang H Y，Ye Q F，Wang W，Wu L C and Wu W X.2006.Cry1Ab protein from GM transgenic rice does not residue in rhizosphere soil.Environment Pollution，143:449 －455.

Wei X D，Zou H L，Chu L M，Liao B，Ye C M and Lan C Y.2006.Field release transgenic papaya effect on soil microbial communities and enzyme activities.Journal of Environmental Sciences，18(4):734 －740.

Wu W，Ye Q，Min H，Duan X and Jin W.2004.GM-transgenic rice straw affects the culturable microbiota and dehydrogenase and phosphatase activities in a flooded paddy soil.Soil Biology Biochemistry，36:289－295.