王 濤, 薩仁高娃, 李鐵剛, 馬學恩, 春 梅, 于心科

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學與醫(yī)學學院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2. 中國科學院 海洋研究所, 海洋地質(zhì)與環(huán)境重點實驗室, 山東 青島 266071)

隨著人類對生命起源的不斷探索, 占地球面積71%的海洋早已成為研究的熱點。作為地球生態(tài)系統(tǒng)最為重要的組成部分, 它自身不僅含有各種豐富的資源, 而且在地球的碳循環(huán)和氧含量中也起著不可替代的作用。海洋生態(tài)環(huán)境獨特, 具有鹽度高, 深層海域高壓、低溫、低營養(yǎng)和光照強度變化大等特點,加之其他極端環(huán)境的存在, 生活在這一復雜環(huán)境中的海洋微生物為適應相應的環(huán)境條件, 在物種類型、代謝類型、功能基因組成和生態(tài)功能上就具有多樣性。海洋微生物種類繁多, 據(jù)統(tǒng)計約 1×106～2×108種,迄今最多只了解了其總量的1%, 甚至更少[1]。

在科學研究手段的不斷發(fā)展和改進過程中, 海洋生態(tài)學研究取得了很大的突破, 人們對海洋微生物的分布及多樣性有了更加深刻的認識。20世紀90年代海洋浮游古菌的發(fā)現(xiàn)與確認改寫了早期認為古菌只存在于極端環(huán)境的論斷, 對于古菌的認識和研究, 都被大大地拓寬了。這三大發(fā)現(xiàn)更是被稱為新近海洋生態(tài)學發(fā)展的三大里程碑[2-3]。

古菌(Archaea)于1977年被首次當作一種生命形態(tài)來看待, 當時它們只是作為細菌中一個獨特的子分支(subset), 因而被稱作為古細菌(Archaebacteria)。古菌與細菌雖同屬于原核生物, 但因它們之間有明確的區(qū)別, 所以兩者均有獨立的世系——域(Domain)——古菌域和細菌域。但隨著科學家們對古菌認識的加深, Woese于1990年正式提出了古菌、細菌、真核生物的三域分界學說[4]。古菌的自身的特性使其能夠生存于海洋的極端環(huán)境以及超微型浮游生物中, 而超微型浮游生物又被廣泛認為是海洋環(huán)境的重要組成部分, 因此, 古菌在地球生態(tài)環(huán)境中的地位十分重要[5-7]。

隨著現(xiàn)代分子生物學的不斷發(fā)展, 許多創(chuàng)新方法與技術被廣泛應用于古菌研究領域, 對古菌的系統(tǒng)分類、多樣性等研究起到了巨大的推動作用。在研究古菌的分子生物學方法中, 16S rDNA文庫分析是最為常用方法之一: 16S rDNA分子大小適中, 在分子生物技術上易于操作, 大量已知微生物的 DNA及16S rDNA序列都被測定并輸入國際基因數(shù)據(jù)庫,研究結(jié)果易于參照比較; 由于 rDNA 有高度的保守性, 通過比較各類原核生物的基因序列的差異, 可以繪制各類原核生物的系統(tǒng)進化樹, 以了解生物在系統(tǒng)發(fā)育上的親緣關系。目前, 16S rDNA文庫分析技術已經(jīng)成為微生物生態(tài)研究領域最重要的研究手段[8], 特別是對于大多數(shù)難以培養(yǎng)的古菌具有深刻意義。

目前國內(nèi)對古菌的研究主要集中在海洋極端環(huán)境和一些能培養(yǎng)的類群上, 而古菌分布的廣泛性研究偏少, 且目前調(diào)查手段普遍采用傳統(tǒng)方法, 調(diào)查區(qū)域過小, 具有一定的局限性。本文古菌16S rDNA基因文庫技術, 試研究黃河三角洲的泥質(zhì)沉積區(qū)表層沉積物中古菌的群落特征及其與周圍環(huán)境的聯(lián)系,為今后在黃河三角洲及黃海區(qū)域開展古菌生態(tài)學研究提供了數(shù)據(jù)信息, 特別是在當前古菌研究主要集中在深海區(qū)域的背景下, 對相應的近海區(qū)域古菌研究也具有一定的參考意義。

1 材料及方法

1.1 樣品來源及采集

本文的研究材料來自黃河三角洲近海岸泥質(zhì)區(qū),6個基因文庫的采樣區(qū)域沿山東半島展開(HSZ-P:36°57.43'N, 123°99.91'E; HSZ-Q: 38°14.70'N,122°89.47'E; HSZ-R: 38°23.69'N, 122°19.03'E;HSZ-W: 37°63.93 N,121°80.83'E; HSZ-S: 35°47.57' N,120°41.95'E; HSZ-T:36°80.10'N,122°70.08'E), 表 層沉積物是由中國科學院科學三號于2009年7月的黃、渤海公益調(diào)查活動中借助表層沉積物采樣器采集。樣品采集過程均在無菌條件下進行, 采集完畢后,將樣品裝入無菌袋中, 保存于–20℃下, 返航后, 將樣品存放于–80℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取

本研究采用土壤 DNA快速提取試劑盒(FastDNA Spin Kit for Soil, QBIOgene, USA)及Fast PrepPTMFP120(Thermo Electron Corp,USA)核酸提取儀對 6個不同站位的泥樣沉積物進行提取。提取實驗完畢后, 取適量基因組 DNA用 1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 以確認是否提取成功。將得到的DNA溶液用不同的離心管進行分裝, 以免在實驗過程中被全部污染。將后續(xù)實驗使用的樣品保存于–20℃, 其余樣品存放于–80℃。

1.2.2 PCR技術擴增

PCR 擴增體系為 100 μmol/L dN TP、1.5 μmol/L MgCl2、1×Taq buffer、0.1 μmol/L 引物、2～5 μL基因組 DNA 作為 PCR 模板、32 ng/μLBSA(Sig2ma)、1.5 U Taq DNA聚合酶(MBI, USA), 反應體系終體積為12.5 μL。為了獲得目的片段, 由上海生工生物工程技術服務有限公司合成了兩條擴增古菌16S rDNA 部分片段的通用引物:

Arch21F (TTCCGGTTGATCCYGCCGGA)和Arch 958R (YCCGCGTTGAMTCCAATT)[12]。其中, Y和M為可變堿基, 其中, Y為C或T, M為A或C。PCR反應條件為: 94℃預變性5 min, 變性95℃ 30 s,復性55℃ 30 s, 延伸72℃ 90 s, 30個循環(huán), 最后72℃再延伸10 min。完成后進行凝膠電泳檢測, 根據(jù)電泳圖選取合適梯度進行平行樣擴增。

1.2.3 基因文庫構(gòu)建

將擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)進行純化, 采用 TaKaRa公司生產(chǎn)的pMD19-T載體進行產(chǎn)物連接, 置于4℃, 6～8 h, 可過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞內(nèi), 用不同濃度涂在帶有Amp抗性LB板上于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h, 初篩陽性克隆。利用水煮法快速提取細胞中的基因組DNA[9]。更換反應體系中的引物, 相應換為 pMD19-T 載體引物: RV-M (5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和 M13-D (5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′), PCR 反應條件相應改為:94℃預變性 5 min, 94℃變性 45 s, 58℃復性 60 s,72℃延伸80 s, 30個循環(huán), 最后72℃延伸10 min。

1.2.4 基因文庫的RLFP分析

將篩選好的陽性克隆產(chǎn)物用MspI 和HhaI(MBI, USA)兩種限制性內(nèi)切酶進行雙酶切。酶切反應需在37℃下進行12～13 h。其產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠(Akeaibao, Spain)進行電泳, 用 ImageMaster VDS凝膠成像系統(tǒng) (Pharmacia Biotech, USA)凝膠成像后, 根據(jù)凝膠圖像劃分不同的RFLP帶型, 選取相對應無重復的陽性克隆進行DNA測序。

1.3 系統(tǒng)進化及統(tǒng)計學分析

1.3.1 系統(tǒng)進化分析

將測序后的所有古菌 16S rDNA 序列按庫分別提交到在線雜合子檢測程序, 檢測其是否為雜合子序列 ( http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)。非雜合子序列在 NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中應用BLASTN 程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對, 找到最相似序列, 為構(gòu)建系統(tǒng)進化樹做準備。

1.3.2 統(tǒng)計學分析

基因文庫中多樣性覆蓋率C(%)的統(tǒng)計結(jié)果由公式C(%)＝[1－(n/N)]×100 計算得出, 其中n指每個16S rDNA文庫中只包含一個克隆的OTUs數(shù), 而N指每個基因文庫的克隆總數(shù)[10]。根據(jù) DOTUR結(jié)果計算各個基因文庫的香農(nóng)-威納(Shannon-Wiener)(H′)、辛普森(Simpson)(D)和均勻度(J′)等多樣性指數(shù)[11]。將 rarefaction數(shù)據(jù)處理后繪制 6個基因庫的稀釋度曲線和數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖表以得到更清晰的結(jié)果。

1.4 在GenBank注冊16S rDNA序列

本研究所測 113個 16S rDNA 序列已提交到GenBank, 注冊號為: HQ267235-HQ267347, NCBI研究人員通過檢測系統(tǒng)認為本次研究提交的 116個序列中有 3個不符合其認定, 故數(shù)量上較統(tǒng)計數(shù)據(jù)少3個。

2 結(jié)果

2.1 古菌16S rDNA文庫分析

本次研究選擇了 6個不同站位的表層沉積物芯樣來構(gòu)建16S rDNA文庫。共篩選出568個陽性克隆,得到了116個RFLP帶型(已除去雜合子)。經(jīng)過測序處理, 用DOTUR軟件進行3%的cut off后, OUTs總數(shù)為77個。經(jīng)計算, 6個基因文庫的樣品覆蓋率普遍較高(介于83%～93%之間, 表1)。綜合6個基因文庫的比較發(fā)現(xiàn), 文庫HSZ-P(Z2)統(tǒng)計的覆蓋率較低, 而其H′,D及J′綜合相比均較高(表1), 這些信息結(jié)合稀釋度曲線能有效地表明該站位的古菌多樣性相對于其他 5個站位是較高的。文庫 HSZK-T(Z8)具有較高的覆蓋率,H′,D,J′(表1), 表明該站位的古菌多樣性相對較低。如6個古菌基因文庫的稀釋曲線所示(圖 1), 當各文庫克隆數(shù)漸近于 100時, 稀釋曲線逐漸趨于平緩, 說明本研究建立的16S rRNA文庫能夠反映古菌群落的基本結(jié)構(gòu)。

圖1 古菌16S rDNA克隆文庫稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of archaeal 16S rDNA clones

表1 古菌16S rDNA克隆文庫分析Tab. 1 Analyses of the archaeal 16S rDNA clones libraries

2.2 古菌16S rDNA序列分析

研究中所有古菌 16S rDNA 序列均來自兩個大類: 泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota),其中97.2 %為泉古菌(圖2)。泉古菌又分為3個類群:主要為Marine Crenarchaeotic Group I(MGI)(88.8%),僅少量 Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG)(7.3%)和 MarineBent hic Group B (MBGB)(1.1%)(圖2); 廣古菌(2.8%)分為兩個類群: 分別是, Terrestrial Miscellaneous Euryarchaeotic Group(TMEG)(2.3%)和Marine Benthic Group D(MBGD)(0.5%)(圖 2)。

綜合6個基因文庫進行比較, 我們可以發(fā)現(xiàn), 隨著樣品采集地點(HSZ-T—HSZ-R)離海岸由近至遠,古菌種類有漸增的趨勢, 相應地, 其他菌類在各基因文庫所占比重也相對明顯增大(圖2)。本次研究共構(gòu)建了6個16S rDNA文庫, 其中60個OTUs(代表505個克隆)均屬于 MGI, 可見無論在數(shù)量還是多樣性上, MGI均廣泛分布于6個不同的16S rDNA文庫中, 并占有絕對的比重(表2)。MGI最早發(fā)現(xiàn)于海水中[12], 是海水中古菌的主要類群[13-15], 也廣泛分布于沉積物中。本次研究中的MGI的同源序列多來自與韓國濟州島邊緣海域、美國江河流域以及太平洋淺海沉積物, 個別序列會對上深海區(qū)域, 如鄂霍次克海冷泉環(huán)境(圖3)。

圖2 沉積物中古菌群落的多樣性分析及其在各文庫中的分布情況Fig. 2 Diversity and distribution of archaeal communities in surface sediments

表2 古菌16S rDNA文庫克隆系統(tǒng)發(fā)育歸屬關系Tab. 2 Phylogenetic affiliations of archaeal 16S rDNA clone libraries

泉古菌中, MCG在6個站位均有分布。MCG廣泛存在于多種陸地和海洋環(huán)境, 在海水和沉積物中均有大量分布[16-17,23]。MBGB也稱Deep-Sea Archaeal Group(DSAG), 最早發(fā)現(xiàn)于深海沉積物和熱液口環(huán)境中[16], 是鄂霍次克海近岸黏土沉積物中的優(yōu)勢類群[17]。隨著研究手段不斷發(fā)展, 發(fā)現(xiàn)該類群也廣泛分布于多種深海環(huán)境, 如大西洋深海沉積物、海底泥火山、黑海碳酸鹽殼、貧有機物的深海海盆以及大陸邊緣有機物富含甲烷或甲烷水合物的沉積物, 是秘魯邊緣 1230站位甲烷-硫酸鹽轉(zhuǎn)換帶中古菌的優(yōu)勢類群[19-21,22]。在本研究中 MBGB分布并不廣泛, 只在HSZ-P(Z2)和HSZ-Q(Z3)檢測到, 數(shù)量很少。

TMEG廣泛分布于陸地和淡水環(huán)境, 在海底沉積物中也有分布, 如秘魯邊緣1231站位[19,23]。TMEG在除了 HSZ-R(Z4)的其他站位均有分布, 且在基因文庫中的數(shù)量也僅次于MGI和MCG。其同源序列(相似度 97%～99%)分別來自于江河流域以及鄂霍次克海, 兩者的共同點是均來自于沉積物中。MBGD: 也稱 MG-III (Marine Group III), 是熱原體目(Thermoplasmatales)中的一個重要進化分枝。MBGD最初發(fā)現(xiàn)于大西洋陸坡和新英格蘭離岸深海平原[18,22]。該類群古菌可能僅生活于深海沉積物中,在海水及近岸的沉積物中極少發(fā)現(xiàn)。本次研究中,離海岸相對較近的站位中均沒有檢測到 MBGD的存在, 且 MBGD的分布范圍較小, 其數(shù)量也為最少,在 568個克隆中, 僅僅檢測到 3個克隆序列屬于MBGD(表 2)。

3 討論

本文以黃河三角洲泥質(zhì)沉積區(qū) 6個不同站位的表層沉積物中的的古菌作為研究對象, 應用成熟的16S rDNA序列分析技術, 結(jié)合傳統(tǒng)的統(tǒng)計學分析和系統(tǒng)進化分析, 對獲得DNA序列進行處理統(tǒng)計。由于絕大部分古菌的不可培養(yǎng)性, 采用這些非培養(yǎng)技術能夠較好地評估沉積樣品中古菌的多樣性。測序后, 通過與網(wǎng)上序列的同源比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,可以較為準確的地反應樣品采集區(qū)域的古菌種類及其分布情況。盡管分子生物學方法也有其缺點(如:樣品總DNA的提取效率偏差; PCR過程中產(chǎn)生的偏差; 挑取克隆的隨機性), 但這些方法已經(jīng)是繞過傳統(tǒng)培養(yǎng)對特定區(qū)域進行目的性研究的最佳手段。

圖3 黃海沉積物中古菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of the archaeal 16S rRNA gene sequences recovered from the Yellow River

為了更加準確地研究古菌的多樣性, 還采用傳統(tǒng)的統(tǒng)計學方法如香農(nóng)威納、辛普森等多樣性指數(shù)以及繪制系統(tǒng)進化樹進行分析, 結(jié)果表明研究區(qū)域中6個站位的古菌多樣性較低, 僅檢測到5種類群。MGI 這種常見古菌為研究區(qū)域的優(yōu)勢菌群, 且在各個基因文庫分布較為均勻, 克隆數(shù)隨著采樣站位離海岸距離的拉大而相對減少。MCG為該次研究的第二大古菌類群, 其各個文庫的分布與MGI基本相似,而這兩類古菌是海洋中分布范圍最廣的類群。在本次研究中, 廣古菌的克隆數(shù)僅占總克隆數(shù)的 3.7%,TMEG是其優(yōu)勢菌群, 并在5個文庫中有分布。究其原因, 推斷認為沉積物中的古菌群落結(jié)構(gòu)可能受海域和菌群自身的適應性所影響。就表層而言, 其具有沉積時間較晚和沉積于淺表等特點, 且由于研究區(qū)域處于黃河入?？诟浇? 沉積物的遷移沉積過程中,一些河口的古菌也隨之遷移沉積, 并逐漸適應新遷移的環(huán)境[24], 以致研究結(jié)果與本實驗室以前的深海古菌研究有較大差異(古菌種類與深海相比較少, 多樣性偏低), 從而間接證明了表層沉積物中微生物的群落結(jié)構(gòu)異于深層沉積物。也有研究表明近海沉積物中微生物群落相當穩(wěn)定, 受季節(jié)變化的影響很小,這種相對穩(wěn)定是因為優(yōu)勢群落在全年普遍存在, 且比例很大[25-26]。

通過網(wǎng)上比對, 發(fā)現(xiàn)本次研究中16S rDNA序列與其在GenBank中的同源序列的相似度基本在90%以上(介于 93%～99%)。為進一步減小古菌歸類的誤差, 應用 Dotur軟件處理序列后得到確切 OUT數(shù),發(fā)現(xiàn)研究區(qū)域古菌的同源序列多來自于韓國濟州島附近海域、河口流域以及太平洋海域的表層沉積物。

綜合對16S rDNA進行分析后發(fā)現(xiàn), 來源于黃海近海岸表層沉積物的古菌序列主要出自于泉古菌,它的克隆數(shù)為總克隆數(shù)的96.3%, 且以MGI為主(占總克隆數(shù)的 88.8%)。MGI是海水中古菌的主要類群[14,15], 也廣泛分布于沉積物中。本研究古菌均來自于沉積樣品中, 也間接佐證了類似觀點。有研究表明,MGI中的某些類群參與氨氧化過程, 在海洋氮的生物地球化學循環(huán)中起著主要的作用[27]。山東半島河海入?？诒姸? 大量泥質(zhì)沉積物被沖刷入海; 加之人類活動的污染, 導致黃海近海海域氮富集, 推測這可能也是 MGI菌類偏多的一大因素。MCG也是本次研究的主要古菌類群之一, 廣泛存在于多種陸地和海洋環(huán)境, 是秘魯邊緣1227和1229站位、鄂霍次克海近岸火山灰沉積物以及 Nankai 海槽等環(huán)境中古菌的優(yōu)勢菌群[17,28]。本次研究所獲得的古菌種類均來自于泉古菌和廣古菌, 有報道指出, 海洋中古菌主要為泉古菌, 僅有小部分廣古菌[15]。對比以往深海古菌研究結(jié)果, 本次研究中泉古菌所占比重相較廣古菌更大; 從古菌多樣性上來說相對偏少。古菌的同源序列多來自于江河流域, 以及沉積物當中;部分古菌因采樣地點原因, 與韓國濟州島海域古菌有很高的同源性; 此外, 有相當數(shù)量的同源序列是具有金屬依賴性的——本次研究采樣地點在山東半島近海岸的黃海海域內(nèi), 由于處于江河入?？诟浇?自然環(huán)境復雜, 加之近海海域的金屬污染, 故推測這一現(xiàn)象可能與該海域特征有極大關聯(lián)。

雖然本次研究檢測到的古菌種類偏少, 但還是可以認識到古菌這種生物類群的分布是及其廣泛的,它并不是只能存在于極端的海洋環(huán)境中, 不論是不同層位的縱向分布上, 還是不同海域的橫向分布上;不論是江河流域近, 還是深海冷泉熱液, 我們都可以發(fā)現(xiàn)它的存在, 這種古老的生命形態(tài)長期存在并參與著海洋生理生化作用, 與海洋環(huán)境相互影響。

4 小結(jié)

通過對黃河三角洲泥質(zhì)沉積區(qū)古菌的研究, 綜合應用RFLP技術、16S rRNA基因文庫技術以及統(tǒng)計學等方法進行分析, 發(fā)現(xiàn)山東半島的黃海近海海域的古菌類群并不豐富, 本次研究只檢測到包括MGI在內(nèi)的 5種古菌類群, 與深海古菌有較高的多樣性相比, 存在著明顯差異。6個基因文庫的對比也表明, 古菌類群在研究區(qū)域的橫向分布上也沒有顯著的差異, 只是隨著離海岸距離的拉大, 除 MGI外其他古菌的克隆數(shù)有所增加, 但個數(shù)相對總體克隆數(shù)而言并不算多, 這樣的統(tǒng)計結(jié)果可能與環(huán)境、水深、沉積物的理化特征有關。此外, 通過網(wǎng)上序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建, 發(fā)現(xiàn)研究區(qū)域部分古菌的同源序列與甲烷厭氧氧化、金屬依賴性古菌相似度很高, 這也可能反映了該區(qū)域的環(huán)境特征。這些研究結(jié)果不僅說明了黃河三角洲泥質(zhì)區(qū)古菌垂向分布特征, 也為今后在黃海區(qū)域開展古菌生態(tài)學及相關環(huán)境研究提供了數(shù)據(jù)信息。

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