海洋貝類功能基因的研究進(jìn)展

周小龍 , 鄭云云 董迎輝 林志華

(1. 浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源有效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315100; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

本世紀(jì)初人類基因組序列圖譜的完成從分子水平上揭示了DNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)和遺傳機(jī)制的本質(zhì), 極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展, 同時(shí)也使人們意識到基因資源的巨大科研和商業(yè)價(jià)值。在此后的 10年間,基因組測序及分析技術(shù)取得了一系列重大突破, 大量模式生物基因組數(shù)據(jù)庫相繼發(fā)布, 生物信息量呈爆發(fā)式增長。在海洋貝類方面, 有太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)全基因組序列圖譜的完成[1]、文蛤(Meretrix meretrix)[2]和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)[3]轉(zhuǎn)錄組以及蝦夷扇貝[4]、文蛤[5]、泥蚶(Tegillarca granosa)[6]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[7]等多種貝類cDNA文庫的成功構(gòu)建等。如何利用這些海量生物信息來預(yù)測、挖掘和鑒定新的重要功能基因并闡明其表達(dá)調(diào)控機(jī)制, 已成為貝類分子遺傳學(xué)的一個(gè)重要發(fā)展方向。本文結(jié)合近年來的相關(guān)文獻(xiàn), 對海洋貝類功能基因的研究方法、現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述, 同時(shí)闡述了現(xiàn)階段存在的問題。

1 功能基因的結(jié)構(gòu)和研究方法

1.1 功能基因的結(jié)構(gòu)

功能基因是DNA上編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的遺傳信息的基本單位。功能基因包括能夠轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)mRNA并編碼蛋白的編碼區(qū)和起調(diào)控作用的非編碼區(qū), 在編碼區(qū)上游有一小段核苷酸序列被稱為啟動(dòng)子, 是 RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn),是轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn), 相應(yīng)的在編碼區(qū)下游有一小段核苷酸序列被稱為終止子, 是轉(zhuǎn)錄的終止點(diǎn)。功能基因的研究就是在了解基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上, 確定基因的功能, 主要包括開放閱讀框的確定, 基因時(shí)空表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制以及表達(dá)產(chǎn)物的功能分析。

1.2 研究功能基因的方法

1.2.1 表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(EST)

EST技術(shù)是在建立生物特定組織cDNA文庫的基礎(chǔ)上, 對文庫中的 EST序列進(jìn)行測序, 然后和GENBANK核酸數(shù)據(jù)庫中已有的cDNA進(jìn)行相似性檢測, 進(jìn)而得到特定功能基因的技術(shù)。該技術(shù)在大批量篩選和獲得功能基因的研究中有重要的作用, 也是目前研究貝類功能基因最常用的方法。

1.2.2 基因芯片技術(shù)(Gene chip)

基因芯片技術(shù)是將數(shù)以萬計(jì)的已知核苷酸片段有序的固定在固相載體上, 然后將帶有同位素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記的待檢測分子片段與之雜交, 再使用計(jì)算機(jī)對雜交信號的強(qiáng)弱進(jìn)行檢測和分析, 從而獲得待檢測分子片段的表達(dá)情況?；蛐酒夹g(shù)具有耗時(shí)短、效率高的特點(diǎn), 在疾病檢測、多態(tài)性分析、篩選和確定功能基因的用途上有巨大的潛力。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Transgenic technology)

轉(zhuǎn)基因又稱基因轉(zhuǎn)導(dǎo), 是將目的基因通過某種手段整合到受體胚胎或者細(xì)胞中去, 使之表達(dá)外源蛋白, 然后觀察受體的生物學(xué)變化, 進(jìn)而了解目的基因在受體中的功能, 轉(zhuǎn)基因是研究基因功能最常用、最成熟的技術(shù)之一[8]。早在1985年朱作言院士就成功的獲得了轉(zhuǎn)基因鯽[9], 現(xiàn)正努力實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因魚的商品化。

1.2.4 基因打靶技術(shù)(Gene targeting)

基因打靶是在同源重組的理論基礎(chǔ)上, 利用受體細(xì)胞基因組和與之有相同或者相似序列的外源基因片段發(fā)生同源重組的手段, 將目的基因整合到受體基因組中并表達(dá), 從而研究目的基因功能的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)近年來還演化出一種新的技術(shù)—— 基因誘捕, 基本原理是: 插入的DNA使內(nèi)源基因突變,并在被誘捕序列啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下, 表達(dá)插入的報(bào)告基因以鑒定突變[8]。

1.2.5 建立遺傳連鎖圖譜(Genetic linkage map)

遺傳連鎖圖譜是指以遺傳距離表示基因組內(nèi)基因以及專一的多態(tài)性DNA標(biāo)記相對位置的圖譜, 完成遺傳圖譜就可以對其功能基因進(jìn)行準(zhǔn)確的定位, 這對于功能基因的克隆和優(yōu)良品種的選育具有重大的意義。

1.2.6 RNA干涉(RNA interference, RNAi)

RNA 干涉是指外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后引發(fā)生物體內(nèi)基因的同源序列降解, 從而使基因轉(zhuǎn)錄后表現(xiàn)出沉默的現(xiàn)象[8]。通過形成 dsRNA, 產(chǎn)生RNA干涉, 使目的基因沉默, 從而進(jìn)一步研究目的基因的功能, 這種特性使得 RNAi在功能基因組的研究中, 成為一種強(qiáng)有力的工具。

2 國內(nèi)外海洋貝類功能基因的研究進(jìn)展

2.1 生長發(fā)育調(diào)控基因研究

貝類的生長速度、體型大小、肉質(zhì)鮮度等經(jīng)濟(jì)性狀是科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn), 因此與之相關(guān)的生長、發(fā)育、代謝相關(guān)基因向來是功能基因研究的重點(diǎn)。在海洋經(jīng)濟(jì)貝類中也已經(jīng)展開了大量相關(guān)研究,近年來報(bào)道的與生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的基因列于表1。

表1 貝類生長和發(fā)育相關(guān)基因

肌動(dòng)蛋白(actin)基因是在海洋貝類中研究比較多的功能基因, 在肌原纖維、細(xì)胞遷移、胞漿移動(dòng)、染色體分離、細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞內(nèi)吞和外排、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面發(fā)揮著重要作用[32-37]。脊椎動(dòng)物中, 已鑒定出6種actin蛋白。盡管已經(jīng)有多種海洋貝類的actin基因被克隆出來, 但只檢測出α、β兩種類型的actin基因。

肌球蛋白基因也是一類研究的比較多的基因,尤其是在扇貝中。肌球蛋白廣泛參與細(xì)胞的活動(dòng), 包括細(xì)胞遷移、跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞器定位、信號傳導(dǎo)及RNA定位等, 不同種類的肌球蛋白各自行使不同的功能[38]。

除此之外, 還有一些在貝類生長發(fā)育過程中起重要作用的酶類, 其基因已經(jīng)被成功地克隆出來。王嘉[27]通過 RACE法克隆獲得了皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)L-古洛糖酸-l,4-內(nèi)酯氧化酶(GLO)的基因全長序列。這是國際上第一次從除原生動(dòng)物利什曼原蟲之外的無脊椎動(dòng)物上克隆出GLO的cDNA全長序列, 證明了皺紋盤鮑有 GLO活性, 進(jìn)而推翻了此前認(rèn)為無脊椎動(dòng)物沒有VC合成能力的假設(shè)。

還有與珍珠質(zhì)形成或外套膜代謝相關(guān)的基因,研究比較多的有nacrein蛋白基因及其類似基質(zhì)蛋白的基因, nacrein蛋白具有催化 CO2水合反應(yīng)和結(jié)合 Ca2+的功能, 這類蛋白可能參與珍珠層碳酸鈣晶體的形成, 對碳酸鈣晶體的沉淀具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。

2.2 抗逆相關(guān)功能基因

近年來貝類頻頻發(fā)生大規(guī)模的病害事件, 不僅造成了大量的經(jīng)濟(jì)損失, 而且影響了人們對貝類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的信心。為了改良種質(zhì), 培養(yǎng)具有更高抗逆能力的品系, 貝類抗逆相關(guān)基因的篩選和分析成為了貝類功能基因研究中的熱點(diǎn)。其中抗氧化酶基因、熱休克蛋白基因、金屬硫蛋白基因是迄今研究比較多的海洋貝類抗逆相關(guān)基因。

表2 貝類抗逆相關(guān)基因

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等所構(gòu)成的抗氧化酶系統(tǒng)在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能, 以維持氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡,可以有效地防止過量活性氧對機(jī)體造成損傷[52-53]。近年來關(guān)于抗氧化酶基因的研究相當(dāng)豐富, 在櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[28-39]、香港巨牡蠣(C. hongkongensis)[42]、皺紋盤鮑[43]等多種貝類中克隆得到了多種類型的抗氧化酶基因。

熱休克蛋白(HSP)是另一類與抗逆相關(guān)的蛋白,生物體在受到高溫脅迫、缺氧、重金屬離子、氨基酸類似物等應(yīng)激刺激下, 以及機(jī)體內(nèi)的生理改變,都可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生熱休克反應(yīng)[54]。HSP70家族是熱休克蛋白超家族的重要成員, 也是在貝類中研究最多的熱休克蛋白, 櫛孔扇貝[19]、蝦夷扇貝、海灣扇貝(Argopecten irradians)[44]、皺紋盤鮑[45]、合浦珠母貝(Pinctada fucata)和企鵝珍珠貝(Pteria penguin)[46-47]等貝類的HSP70基因已經(jīng)成功克隆。并有學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)對高溫、低溫、細(xì)胞感染、水質(zhì)惡化等特定條件下櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝不同組織中HSP70的誘導(dǎo)和基因表達(dá)進(jìn)行了初步研究[44]。此外還得到了香港巨牡蠣和皺紋盤鮑HSP90 基因[12,43]。

金屬硫蛋白 (metallothionein, MT)基因也是一類重要的抗逆相關(guān)基因, 其在生物體內(nèi)參與細(xì)胞內(nèi)金屬的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、重金屬解毒、清除自由基、抵抗電離輻射等, 具有較強(qiáng)的生物學(xué)功能。在應(yīng)用上由于MT基因的可誘導(dǎo)性、易選擇性和高水平表達(dá)的特點(diǎn),常將 MT的啟動(dòng)子連接在要表達(dá)的某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因前面, 從而使外源基因可以高效可控地表達(dá)出來[55]。另外, 經(jīng)常將 MT作為重金屬污染的一種早期生物反應(yīng), 例如貽貝整體軟組織或鰓中 MT的水平可作為環(huán)境中Cd、Hg、Ag和Cu污染的生物標(biāo)志[56-57]。目前, 已知克隆出 MT基因的貝類有海灣扇貝[48]、大珠母貝(P. maxima)[49]、香港巨牡蠣[12]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[50]、文蛤[51]等。還有研究證明了鎘刺激和鰻弧菌均能誘導(dǎo)海灣扇貝MT基因(AIMT)的表達(dá), 推測 AIMT在一定程度上參與了海灣扇貝與病原相互作用的過程[48]。

另外太平洋牡蠣(C. gigas)脅迫相關(guān)基因鐵硫蛋白(Rieske protein)也得到成功克隆, 組織分布表明,鐵硫蛋白在多種組織中都具有廣泛表達(dá), 其中在閉殼肌中的表達(dá)量最高; GFP融合表達(dá)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果表明, 鐵硫蛋白主要定位于線粒體上[12]。

2.3 抗病相關(guān)功能基因

2.3.1 貝類固有免疫概況

貝類等無脊椎動(dòng)物抵御病害主要依靠固有免疫,即依靠血細(xì)胞的吞噬作用和血淋巴中各種非特異性免疫活性因子的復(fù)雜作用, 來實(shí)現(xiàn)機(jī)體對外來物的防御。固有免疫曾一直被認(rèn)為是向獲得性免疫進(jìn)化的初級形式, 是一種應(yīng)答外界刺激的低級表現(xiàn)。但近十幾年來, 隨著對免疫系統(tǒng)研究的深入, 固有免疫的重要性越來越顯現(xiàn)出來。貝類免疫過程可分為非己識別、絲氨酸蛋白級聯(lián)反應(yīng)、病原清除三個(gè)階段,相關(guān)基因分類比較明確, 具體基因種類和相應(yīng)信息見表3。

2.3.2 非己識別相關(guān)功能基因

1997年美國免疫學(xué)家 Janeway[74]揭示了先天性免疫識別分子作用的本質(zhì), 即宿主通過有限量胚系基因編碼的模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs), 從而識別具有病原相關(guān)分子模式(PAMPs)結(jié)構(gòu)的各種病原體。根據(jù)目前的研究結(jié)果,無脊椎動(dòng)物固有免疫相關(guān)的 PRRs在結(jié)構(gòu)上主要可分為7種類型: C-型凝集素、硫依賴型凝集素、肽聚糖識別蛋白、硫酯蛋白、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白、清道夫受體和類Toll受體[75-76]。

目前在海洋貝類中關(guān)于櫛孔扇貝模式識別受體的報(bào)道最多, 已經(jīng)克隆出了其 C-型凝集素[58]、脂多糖葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)基因、肽聚糖識別蛋白(PGRP-S1)基因[61]、四個(gè)類Toll受體信號通路基因[62]以及含硫酯蛋白、含Clq結(jié)構(gòu)域蛋白[59]等多種基因。其中邱麗梅[62]獲得的 CfMyd88基因, 是在軟體動(dòng)物中獲得的第一個(gè)類 Toll受體的接頭分子, 該結(jié)果直接證明軟體動(dòng)物具有與哺乳動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物高度類似Myd88依賴的Toll樣受體信號通路。此外, 在海灣扇貝中也克隆出了C型凝集素[59]、含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白基因[60]等模式識別受體基因。

2.3.3 絲氨酸蛋白級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)功能基因

非己識別引發(fā)了激活絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng), 從而將受到感染的信號放大為更強(qiáng)的“危險(xiǎn)”信號或解除錯(cuò)誤警報(bào), 這個(gè)過程稱為信號的調(diào)整和放大, 然后引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)而引發(fā)目的基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白合成。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)通過與靶酶相互結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體,從而防止生物體內(nèi)絲氨酸蛋白酶的有害水解激活, 在無脊椎動(dòng)物的免疫應(yīng)答中起著核心作用。

SPI主要有以下四類: Kazal家族、Kunitz家族、Serpin家族以及 α-巨球蛋白。目前的研究主要集中在Kazal家族和Kunitz家族, 而對于另兩種絲氨酸蛋白酶抑制劑基因鮮有報(bào)道。

表3 貝類固有免疫相關(guān)基因

2.3.4 病原清除相關(guān)免疫因子

貝類主要依靠細(xì)胞免疫和體液免疫來清除病原體。細(xì)胞免疫主要指當(dāng)病原體穿透體表物理屏障、進(jìn)入血淋巴后引發(fā)的一系列細(xì)胞防御反應(yīng), 包括吞噬作用、結(jié)節(jié)形成、包囊作用和凝集反應(yīng)等。體液免疫因子包括組成性表達(dá)或誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性分子,主要是血淋巴中具有抗菌、抗病毒、溶菌、識別及凝集活性的效應(yīng)物, 包括各類抗菌因子、抗病毒因子、凝血因子、細(xì)胞激活因子、識別因子、凝集素、溶血素、溶菌酶及水解酶等各種具有免疫活性的物質(zhì)。

溶菌酶是一種堿性蛋白, 它能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖 N-乙酰葡萄糖胺和 N-乙酰胞壁酸之間的β-1, 4糖苷鍵的水解, 導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌死亡[77]。溶菌酶主要?dú)绺锾m氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌, 其在貝類免疫中發(fā)揮著重要作用。在海洋貝類中, 目前已經(jīng)有十多種貝類的溶菌酶基因被成功克隆。值得注意的是, 得到的大部分是i-型溶菌酶基因, 僅從海灣扇貝和櫛孔扇貝中克隆得到g-型溶菌酶基因[39], 從皺紋盤鮑中得到c-型溶菌酶基因[71]。

抗菌肽是指由特定基因編碼的一類具有抗菌活性的雙親性小分子堿性多肽, 是無脊椎動(dòng)物的關(guān)鍵免疫因子。早在 2000年, 就從貽貝(Mytilus edulis)和地中海貽貝(M. galloprovincialis)體內(nèi)分離純化出了四類抗菌肽: 防御素(MGD)、貽貝素(Mytilin)、貽貝肽(Myticin)、抗真菌的貽貝霉素(Mytimycin)[72-73]。但是目前只克隆了MytilinB和MGD-2的基因。近年來, 從海灣扇貝血淋巴中克隆到了大防御素基因(big defensin, AiBD)的全長cDNA序列, 并且通過抑菌實(shí)驗(yàn)證明了 AiBD具有廣譜抗菌活性[66]。還得到了櫛孔扇貝核心組蛋白群的全長序列[65], 包括H2B, H2A,H3和H4這四種組蛋白, 還對H2A基因N末端39個(gè)氨基酸進(jìn)行了重組表達(dá)和抗菌活性分析, 證實(shí)了櫛孔扇貝H2A對于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均具有一定的殺菌活性, 確認(rèn)了該多肽是一種潛在的抗菌肽。

3 貝類功能基因研究存在的問題

當(dāng)今, 海洋生物資源開發(fā)和利用已成為世界各國解決資源問題的有效途徑, 對水產(chǎn)動(dòng)物基因領(lǐng)域的研究, 尤其是重要功能基因的研究已顯得愈發(fā)迫切。迄今, 對海洋貝類功能基因的研究已經(jīng)獲得了一定成果, 各種分子生物學(xué)技術(shù)在研究貝類功能基因的過程中發(fā)揮了重要作用, 大量功能基因被人們成功地克隆出來。但是, 應(yīng)該看到貝類功能基因的研究, 相對于哺乳動(dòng)物甚至魚類功能基因的研究來說還是處于初級階段, 還有很多問題亟待解決。

3.1 在海洋貝類功能基因的研究中使用的方法比較單一

目前普遍使用的方法是依托EST文庫的基因片段測序和同源克隆, 在高等生物上已經(jīng)應(yīng)用的方法如基因芯片技術(shù)、基因打靶技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、RNA干涉等, 由于貝類的物種特殊性,還缺乏有效方法將這些技術(shù)應(yīng)用到貝類功能基因的研究上來。例如, 在魚類中廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù),在貝類則由于一直沒有成功建立體外細(xì)胞系而無法應(yīng)用。

3.2 研究的海洋貝類種類還比較局限

縱觀現(xiàn)有報(bào)道可以發(fā)現(xiàn), 大部分研究是關(guān)于牡蠣、扇貝、皺紋盤鮑, 而同樣作為我國重要經(jīng)濟(jì)貝類的蛤、蚶、蟶等的研究報(bào)道相對較少?，F(xiàn)在牡蠣基因組序列圖譜已繪制完成, 以此為基礎(chǔ), 可以通過同源比對法和同線性分析法, 有效、迅速地挖掘其他海洋貝類功能基因。

3.3 功能基因研究的深度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠

目前的研究通常停留在貝類基因克隆、結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測方面, 但是對于功能基因的功能驗(yàn)證、在體內(nèi)表達(dá)的變化規(guī)律和調(diào)控機(jī)制的研究還不夠深入, 還無法闡明基因型和表型的關(guān)系, 難以將功能基因研究成果作為育種實(shí)踐的指導(dǎo)。

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