絮凝劑產(chǎn)生菌絮凝活性分布及其發(fā)酵條件優(yōu)化

劉清太，裴 璐，付 剛，王永澤，王金華

（1山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司，山東 濰坊262400；2湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢430068）

傳統(tǒng)的無機(jī)鹽絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑（如氯化鋁、聚丙烯酰胺等）在完成污水處理處置工藝后很容易造成水質(zhì)的二次污染，對(duì)人體都有毒害作用［1］.微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞以及膠體粒子等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物［2］，主要包含糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等［3］.它主要包括利用微生物細(xì)胞壁提取物的絮凝劑、利用微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的絮凝劑和直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑.作為一種新興的絮凝劑，它具有安全、高效、可生物降解、不易造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)［4］，因此受到越來越多的關(guān)注和重視.目前，微生物絮凝劑的價(jià)格較高，主要是由于生產(chǎn)成本高和絮凝劑產(chǎn)率較低的原因.這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件影響微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的生理代謝，從而影響微生物絮凝劑的產(chǎn)率.筆者分析絮凝活性的分布以及對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高微生物絮凝劑的產(chǎn)率，為后期的深入研究和實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌（Bacill us sp.）EA，湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院研究室分離保藏.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖，20 g／L；酵母膏，5 g／L；蛋白胨，10 g／L；氯化銨，2.5 g／L；磷酸二氫鉀，2 g／L；硫酸鎂，0.4 g／L；谷氨酸鈉，10 g／L.p H 7，115℃滅菌30 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，40 g／L；谷氨酸鈉，30 g／L；酵母膏，8 g／L；磷酸氫二鉀，0.5 g／L；Mn SO4·H2O，0.1 g／L；Fe Cl3·6 H2O，0.05 g／L；MgSO4·7 H2O，0.5 g／L；CaCl2·2 H2O，0.15 g／L.p H 7，115℃滅菌30 min.

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)液的制備 取1環(huán)斜面菌種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃、180 r／min培養(yǎng)13 h得到種子培養(yǎng)液.

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（250 mL瓶裝50 mL）于37℃、200 r／min震蕩培養(yǎng)72h.

1.2.3 絮凝率測(cè)定方法 以絮凝率表示絮凝活性，測(cè)定方法為：100 mL燒杯中加人0.2 g高嶺土，加50 mL蒸餾水、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Ca Cl2、1 mL發(fā)酵液，調(diào)p H至7.0.相同條件下不添加任何絮凝劑的水樣作為空白對(duì)照.采用磁力攪拌器，分兩段式攪拌：第一段為以120 r／min攪拌2 min；第二段為以80 r／min攪拌3 min，攪拌后靜止沉淀5 min.使用722型分光光度計(jì)在550 n m處測(cè)定上清液吸光度［5］.絮凝率計(jì)算公式如下：

絮凝率＝（A－B）／A×100%.式中：A為對(duì)照上清液550n m處的吸光度；B

為加樣上清液550n m處的吸光度.

1.2.4 絮凝活性的分布 對(duì)同樣體積的未接種培養(yǎng)液、菌株發(fā)酵液（含菌體）、離心去菌體上清液和菌細(xì)胞懸液分別進(jìn)行絮凝活性測(cè)定.

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝活性的分布

按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（250 mL瓶裝50 mL）于37℃、200 r／min震蕩培養(yǎng)72h對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).對(duì)未接種的培養(yǎng)液、菌株發(fā)酵液（含菌體）、離心去菌體上清液和菌細(xì)胞懸液進(jìn)行絮凝活性測(cè)定，相對(duì)應(yīng)的高嶺土懸濁液絮凝率分別為0%、71.7%、74.4%、11.3%.

未接種的培養(yǎng)液絮凝率為零，說明液體培養(yǎng)基中不含有絮凝成分物質(zhì).菌株發(fā)酵液和離心上清液的絮凝率都高達(dá)70%以上.含菌體發(fā)酵液比離心去菌體上清液絮凝率稍低，可能是菌體較輕，在發(fā)酵液中處于懸浮狀態(tài)，阻礙了光的通過［6］.可知EA菌產(chǎn)生的絮凝物質(zhì)主要存在于發(fā)酵液中，是由微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生并分泌到胞外.

2.2 培養(yǎng)基組成對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響

2.2.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)物絮凝特性的影響及最佳碳源含量的優(yōu)化 按照發(fā)酵培養(yǎng)基的材料，不加碳源，配置好250 mL的無碳源發(fā)酵培養(yǎng)基.在培養(yǎng)基的其他成分不變的情況下，更換不同的碳源（各碳源的質(zhì)量相同），在同樣的條件下考察菌株EA的發(fā)酵培養(yǎng)液的絮凝率，不同碳源的絮凝率分別為：甘油，61.3%；葡萄糖，73.2%；蔗糖，67.1%；淀粉，72.3%.可見采用葡萄糖和淀粉作為碳源時(shí)，產(chǎn)物絮凝率較高.在進(jìn)行72 h發(fā)酵培養(yǎng)之后，以葡萄糖作為碳源的發(fā)酵液粘性最大，用此發(fā)酵液對(duì)高嶺土懸濁液進(jìn)行絮凝時(shí)形成的絮體比其他樣品都大，而且在慢攪過程中絮體就已經(jīng)沉降，原本渾濁的液體變得澄清.與此相比，其他幾種碳源雖也有較為明顯的絮凝作用，但形成的絮體較小，沉淀速度較慢.分別測(cè)量四種物質(zhì)作為菌株EA碳源發(fā)酵72 h后菌細(xì)胞懸液的OD值，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖和淀粉為碳源的明顯較大，說明EA菌在含這兩種葡萄糖和淀粉的培養(yǎng)基中的數(shù)量，明顯多于其他兩種碳源的培養(yǎng)基.這兩種碳源，既有利于菌株EA的生長(zhǎng)，又利于絮凝劑的產(chǎn)生.葡萄糖的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，可以被直接吸收利用，有利于細(xì)胞的代謝和產(chǎn)物的合成，故選取葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源.

2.2.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)物絮凝特性的影響及最佳氮源含量的優(yōu)化 按照發(fā)酵培養(yǎng)基的材料，不加氮源，配置好250 mL的無氮源發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下更換不同的氮源（各氮源的質(zhì)量相同），考察發(fā)酵72 h后各個(gè)發(fā)酵液的絮凝率，其試驗(yàn)結(jié)果如下：酵母膏，72.4%；硫酸銨，44.2%；蛋白胨，68.6%；氯化銨，48.5%.可以看出，各氮源對(duì)菌株EA所產(chǎn)絮凝劑的影響較大，且酵母膏和蛋白胨等有機(jī)氮源的絮凝率明顯高于硫酸銨和氯化銨.以酵母膏作為氮源所得到的發(fā)酵液絮凝率最高，故選取酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源.

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響

2.3.1 p H值的影響 用Na OH溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始p H 值，分別為至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0.測(cè)出不同p H值所對(duì)應(yīng)的菌株發(fā)酵產(chǎn)物的絮凝率依次為33.2%、52.3%、69.5%、72.9%、75.2%和71.1%.可見菌株EA的最適初始p H值為7.5.培養(yǎng)基初始p H值過高或過低都不利于絮凝劑的產(chǎn)生，這是因?yàn)镠＋和OH－能夠影響酶蛋白的氨基解離度和電荷情況，改變酶的結(jié)構(gòu)和功能，引起酶活性的改變.而菌的代謝和絮凝劑的產(chǎn)生都是在酶的作用下發(fā)生的生化反應(yīng)，p H值控制H＋和OH－濃度，從而影響菌的代謝和絮凝劑的產(chǎn)生［7］.

2.3.2 溫度的影響 調(diào)節(jié)恒溫震蕩培養(yǎng)箱的溫度，分別設(shè)定為28℃、32℃、37℃、40℃.在菌株發(fā)酵培養(yǎng)72 h后其產(chǎn)物絮凝率分別為49.3%、69.1%、74.6%和73.5%，說明菌株EA在37℃時(shí)產(chǎn)物的絮凝效果最好.溫度過低，細(xì)胞本身的聲場(chǎng)受到抑制，酶促反應(yīng)速度緩慢，影響產(chǎn)物的生成.當(dāng)溫度偏高時(shí)，絮凝率下降，因?yàn)樾跄齽┍旧沓煞质翘堑鞍?、多糖、蛋白質(zhì)、DNA等，高溫可能導(dǎo)致變性，處理效果受到影響［8］.

2.3.3 不同接種量的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入種子液，經(jīng)搖床培養(yǎng)72 h后，分別測(cè)定各組發(fā)酵液的絮凝活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖1 接種量對(duì)絮凝率的影響

接種量為3%時(shí)，絮凝率較高，為75.4%；之后，隨著接種量的增大，絮凝率降低.由于接種量過大，培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高，生長(zhǎng)初期細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖則會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；而接種量過小，培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度低，使得培養(yǎng)周期延長(zhǎng).

2.3.4 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)采用L9（34）方法設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，相對(duì)應(yīng)的三個(gè)因素取為接種量、初始p H值和培養(yǎng)溫度，每個(gè)因素考察3個(gè)水平.正交實(shí)驗(yàn)的因素水平見表1.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 K與各因子之間的關(guān)系

表2中 K1、K2、K3分別表示第1、2、3列中水平對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和.為了比較各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響大小，選出各因素中對(duì)指標(biāo)最有利的水平，以各因素的不同水平為橫坐標(biāo)，以各因素對(duì)應(yīng)的K的平均值為縱坐標(biāo)，作因素和指標(biāo)關(guān)系圖.從圖2中可以看出因素B（培養(yǎng)基初始p H值）的三個(gè)點(diǎn)高低相差較大，即極差R最大，因此對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物絮凝活性的影響最顯著.其次是因素C，影響最小的是因素A，表中最佳培養(yǎng)條件是B3C2A2，即初始p H為7.5，培養(yǎng)溫度為37℃，種子液接種量為4%.選取B2C2A1為培養(yǎng)條件，即選擇單因子實(shí)驗(yàn)時(shí)各因素中最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)其絮凝率為76.6%，小于78.5%.故最佳培養(yǎng)條件為B3C2A2.

3 結(jié)論與展望

通過對(duì)未接種的培養(yǎng)液、菌株發(fā)酵液（含菌體）、離心去菌體上清液和菌細(xì)胞懸液進(jìn)行絮凝活性測(cè)定，得出發(fā)揮絮凝作用的物質(zhì)是EA菌的發(fā)酵產(chǎn)物，是由微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生并分泌到胞外.通過單因子實(shí)驗(yàn)得到最佳碳源是葡萄糖，在以葡萄糖作為碳源時(shí)，EA菌的生長(zhǎng)旺盛，絮凝率最高.在發(fā)酵培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的效果較好，以酵母膏作為氮源時(shí)，絮凝效果最好.通過培養(yǎng)條件單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)條件為：菌株EA發(fā)酵培養(yǎng)的最適初始p H7.5，最適培養(yǎng)溫度為37℃，最適宜接種量為4%.菌株發(fā)酵液的絮凝率也從初始的71.7%提高到78.5%.

在實(shí)驗(yàn)室研究階段培養(yǎng)成本很高，而尋找廉價(jià)的秸稈、纖維素等有機(jī)物質(zhì)含量豐富的廢水等作為培養(yǎng)底物是推動(dòng)微生物絮凝劑工業(yè)化進(jìn)程的重要途徑.其次，利用分子生物學(xué)技術(shù)加強(qiáng)絮凝劑產(chǎn)生菌的絮凝基因研究，把控制絮凝劑生成的基因?qū)氲教囟ǖ奈⑸锛?xì)胞內(nèi)表達(dá)，可以省去篩選的過程并很可能大大提高絮凝劑產(chǎn)率.再次，利用菌株間的相互作用，將絮凝菌同其他污水處理的菌株進(jìn)行復(fù)配，可以拓寬絮凝劑的使用范圍，對(duì)多種污水進(jìn)行處理處置.最后，生物化學(xué)聯(lián)合絮凝劑能很大程度上提高絮凝劑的使用效率和處理效果，也將是今后微生物絮凝劑領(lǐng)域一個(gè)新的研究方向.

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