楊 冰，盧向陽，田 云

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙410128）

用有機(jī)物生產(chǎn)可再生能源是可持續(xù)發(fā)展理念中最重要的方法之一，歐盟已提出到2020年歐洲能源必須有20%來源于可再生能源，而可再生能源的總預(yù)算中用有機(jī)物發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣占25%[1］。我國是一個能源消耗大國，可持續(xù)發(fā)展是我們必須堅(jiān)持的發(fā)展戰(zhàn)略之一。因此，用有機(jī)廢棄物生產(chǎn)可再生能源也將是我國未來可再生能源研究的重點(diǎn)。

厭氧消化技術(shù)是應(yīng)用得最廣泛的將有機(jī)廢棄物轉(zhuǎn)化為甲烷的技術(shù)，它除了能穩(wěn)定降解有機(jī)廢棄物產(chǎn)生沼氣外，還有生物量低、有機(jī)物裝載率高、營養(yǎng)需求限度低、運(yùn)行和維護(hù)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[2］。

厭氧消化過程主要包括兩個步驟：一是高分子有機(jī)物的分解；二是分解后物質(zhì)的甲烷化。甲烷化是厭氧消化的限速步驟，主要靠產(chǎn)甲烷古細(xì)菌將厭氧消化產(chǎn)生的有機(jī)或無機(jī)化合物厭氧發(fā)酵生成甲烷。在有機(jī)物厭氧消化的甲烷化過程中，70%以上的甲烷來自乙酸的裂解[3，4］，而目前所知，只有甲烷鬃毛菌（Methanosaeta）和甲烷八疊球菌（Methanosarcineae）能裂解乙酸產(chǎn)生甲烷[5］。但是當(dāng)反應(yīng)器中乙酸濃度超過3000mg·L－1時(shí)甲烷鬃毛菌就無法生長，而甲烷八疊球菌在乙酸濃度高達(dá)15 000mg·L－1的發(fā)酵液中仍能利用乙酸產(chǎn)生甲烷[6～8］。因此，甲烷八疊球菌在有機(jī)物厭氧消化中起著重要的作用。目前，歐美國家對甲烷八疊球菌的研究已進(jìn)入分子機(jī)理研究階段，但我國對甲烷八疊球菌研究的報(bào)道還比較少。

通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，作者在此對甲烷八疊球菌的特征和應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 甲烷八疊球菌的分類

甲烷八疊球菌屬于古細(xì)菌域（Archaea）、廣古菌門（Euryarchaeota）、甲烷球菌綱（Methanococci）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、甲烷八疊球菌科（Methanosarcinaceae）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）。1947年，荷蘭學(xué)者Sehnellen[9］首次分離出了甲烷八疊球菌屬并命名為Methanosarcina barkeri。隨后各國科學(xué)家又相繼分離到M.acetivorans、M.baltica、M.lacustris、M.mazei、M.semesiae、M.siciliae、M.thermophila、M.vaculolata等8個甲烷八疊球菌種[10］。

2 甲烷八疊球菌的特征

2.1 形態(tài)特征（圖1）

圖1 甲烷八疊球菌細(xì)胞的顯微照片[11］Fig.1 Micrographs of Methano sarcineae[11］

甲烷八疊球菌通常是8個單細(xì)胞以圖1a中的形式進(jìn)行生長，它存在2種不同的形態(tài)：在淡水中生長時(shí)，以聚集形式存在，細(xì)胞外包裹著雜多糖基質(zhì)（圖1b）；在高鹽環(huán)境中生長時(shí)，則是以分散形式存在，沒有胞外聚合物層（圖1c）[11～13］。甲烷八疊球菌是唯一能夠通過胞外多糖形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的古細(xì)菌，胞外多糖的形成是甲烷八疊球菌的一種自我保護(hù)機(jī)制，它能吸收水作為濕潤劑，保持細(xì)胞內(nèi)的水活度；同時(shí)也能減少擴(kuò)散到細(xì)胞的氧，保護(hù)細(xì)菌免受氧的損害[12］。

2.2 代謝特征

甲烷八疊球菌是已知的唯一能夠利用所有已知產(chǎn)甲烷途徑（乙酸營養(yǎng)途徑、氫營養(yǎng)途徑和甲基營養(yǎng)途徑）的產(chǎn)甲烷微生物菌屬[14～16］。第一種途徑是乙酸裂解生成甲烷，同時(shí)生成的CO與H2O反應(yīng)生成CO2和H2；第二種途徑是以CO2和H2為原料合成甲烷；第三種途徑是以各種甲基化合物（甲醇、甲胺、甲基硫化物）為底物，在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成甲烷[17］。如圖2所示。

正是由于存在如此多的代謝途徑，使甲烷八疊球菌成為厭氧消化中最重要的產(chǎn)甲烷菌群。

圖2 甲烷生物合成途徑[14］Fig.2 The synthetic pathways for methanogenesis[14］

2.3 基因組特征

2002年，M.acetivorans和M.mazei的全基因組測序完成[14，18］；2007年又完成了 M.barkeri的基因組測序[19］。甲烷八疊球菌基因組特征比較見表1 。

表1 甲烷八疊球菌基因組特征比較[19］Tab.1 Comparison of genomic features among Methanosarcinaspp.

由表1 可知，甲烷八疊球菌的基因組大小約為4.0×106～6.0×106bp，G＋C含量在39%～43%之間，編碼蛋白質(zhì)的ORE約為3300～4600個，基因組有功能部分比 例 約 為70% ～75%[14，18，19］。隨 著 這 3 個 菌種的全基因組測序的完成，人們對甲烷八疊球菌的遺傳特征有了全面的認(rèn)識，上述3種菌也因此成為研究產(chǎn)甲烷古細(xì)菌的模式菌種[20］。

甲烷八疊球菌的代謝路徑多樣，某一底物代謝路徑相關(guān)基因的改變或敲除并不影響菌株在其它底物上的生長，這有利于用基因分析的方法研究其生長機(jī)制和產(chǎn)甲烷路徑。針對這些種屬的遺傳工具也相繼開發(fā)出來，包括對特定基因的定向突變和表達(dá)調(diào)控的工具如鏈霉菌屬噬菌體φC31載體[21，22］；許多代謝重建菌株，如 M.acetivorans iMB745[15］可用于假定的藥物靶點(diǎn)的識別和設(shè)計(jì)利于生物燃料生產(chǎn)的菌株；同時(shí)M.barkeri Fusaro[12］已用于研究產(chǎn)甲烷古細(xì)菌的耐旱機(jī)制、M.mazei Go1[23］用于研究產(chǎn)甲烷古細(xì)菌的耐鹽機(jī)制等。

3 甲烷八疊球菌在厭氧消化中的應(yīng)用

3.1 產(chǎn)甲烷

厭氧消化雖然是目前被廣泛應(yīng)用的可再生能源生產(chǎn)的重要技術(shù)手段，但產(chǎn)甲烷菌群對不同環(huán)境的高度敏感性（pH值的改變、鹽和有機(jī)物濃度的增加、負(fù)載率的增大、有毒物質(zhì)的產(chǎn)生）易導(dǎo)致系統(tǒng)的崩潰[2，24，25］。這是由于，在消化過程中要維持不同微生物組合之間的微妙平衡，其中產(chǎn)甲烷菌是最易受到損害的，而甲烷八疊球菌通常能夠耐受不同的逆境因子[26，27］，對銨鹽毒害、超負(fù)載率、高鹽濃度、溫度變化等逆境因子都有很強(qiáng)的抗性[28］。表2 是主要的產(chǎn)甲烷菌甲烷鬃毛菌和甲烷八疊球菌的的特點(diǎn)比較。

表2 甲烷鬃毛菌和甲烷八疊球菌的特點(diǎn)比較[28］Tab.2 Comparison of features between Methanosaetaand Methanosarcina[28］

由表2 可看出，無論是最大比生長速度（μmax）、半飽和常數(shù)（Ks）還是對各種逆境因子的耐受性，甲烷八疊球菌都比甲烷鬃毛菌要高得多。

3.2 水下陰極選擇性增殖培養(yǎng)

厭氧消化中產(chǎn)甲烷菌的生長速度很慢，因此成為限制發(fā)酵速度的主要因素，但相比于其它產(chǎn)甲烷菌，甲烷八疊球菌的生長速度要快2～20倍[8］。所以加快產(chǎn)甲烷菌的生長速度并延長滯留時(shí)間，就能擴(kuò)大厭氧消化器的處理能力。為了達(dá)到這一目的可在反應(yīng)器中增設(shè)水下產(chǎn)氫陰極，選擇性地加強(qiáng)氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長[7，29］。而甲烷八疊球菌既是氫營養(yǎng)型的又是乙酸營養(yǎng)型的，還能產(chǎn)生具有粘附作用的胞外多糖，能附著在陰極上生長[7，30］，同時(shí)在陽極端產(chǎn)生氧氣為水解微生物創(chuàng)造有氧條件，促進(jìn)有機(jī)物的水解作用。通過在厭氧反應(yīng)器中引入陰極（－0.8V）和陽極（＋0.8V），可加快甲烷八疊球菌和水解菌的生長速度并延長滯留時(shí)間，從而提高沼氣生產(chǎn)和反應(yīng)器的穩(wěn)定性，使甲烷的產(chǎn)率提高10%～25%[29］。

3.3 組合發(fā)酵

厭氧消化產(chǎn)甲烷主要靠兩條途徑：一是乙酸直接裂解生成CH4和CO2（乙酸營養(yǎng)型）；二是利用H2還原CO2生成CH4（氫營養(yǎng)型）[31］。當(dāng)反應(yīng)器的氨濃度升高、pH值減小時(shí)，部分乙酸被互養(yǎng)乙酸氧化（Syntrophic acetate oxidizing，SAO）菌氧化為 CO2和 H2，而不是被乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌直接轉(zhuǎn)化為甲烷[32，33］。但是乙酸氧化生成CO2和H2在熱力學(xué)上是非常不利的（△G0′＝104.6kJ·mol－1），SAO細(xì)菌只有在 H2分壓非常小（2.6～74Pa）時(shí)才能完成這一氧化過程，因此只有當(dāng)互養(yǎng)乙酸氧化菌和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷（Hydrogenotrophic methanogenesis，HM）菌 耦 合（SAO－HM），乙酸的甲烷化才可以順利進(jìn)行[32，34］。研究發(fā)現(xiàn)[35］，當(dāng)反應(yīng)器中總氨濃度上升到3000mg·L－1或 乙酸濃度達(dá)到3000mg·L－1時(shí)，厭氧消化系統(tǒng)的甲烷生成途徑就會由乙酸營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)闅錉I養(yǎng)型。

甲烷八疊球菌既可以進(jìn)行乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷又可以進(jìn)行氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷，如果以它們作為產(chǎn)甲烷菌群與SAO細(xì)菌耦合，基于以上原理，當(dāng)反應(yīng)器負(fù)載增大或由于突然的損害導(dǎo)致氨或乙酸濃度升高時(shí)，就不需要進(jìn)行菌群的變化，而只需要甲烷八疊球菌改變生理特性，由乙酸營養(yǎng)變?yōu)闅錉I養(yǎng)就好，這樣就縮短了反應(yīng)器應(yīng)對干擾的時(shí)間，提高了反應(yīng)器的穩(wěn)定性和處理能力[28］。

4 結(jié)語

古菌群對環(huán)境的敏感性易導(dǎo)致厭氧消化產(chǎn)甲烷反應(yīng)系統(tǒng)崩潰，而甲烷八疊球菌因其遺傳和代謝的特點(diǎn)成為彌補(bǔ)這些缺陷最有潛能的菌種。甲烷八疊球菌能夠耐受高氨、高鹽、高乙酸濃度，其獨(dú)特的表面結(jié)構(gòu)使可以在水下陰極上生長，與SAO細(xì)菌的耦合可以增強(qiáng)厭氧消化反應(yīng)器的性能。

甲烷八疊球菌有如此多的優(yōu)越性，可能是未來厭氧消化系統(tǒng)能源轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，因此，可以利用分子生物學(xué)技術(shù)，如插入啟動子、插入甲烷合成相關(guān)基因、敲除相關(guān)阻遏基因等，對它們進(jìn)行進(jìn)一步的改造，使它們能更好地應(yīng)用于生產(chǎn)；同時(shí)還可以用組合菌研究的方法篩選可以與之耦合的最適SAO細(xì)菌；因甲烷八疊球菌Ks（200～280mgCOD·L－1）比較大，在發(fā)酵初期轉(zhuǎn)化效率低，故也可以與Ks比較小的甲烷鬃毛菌（10～50mgCOD·L－1）組合來提高初期轉(zhuǎn)化效率，以進(jìn)一步發(fā)掘其產(chǎn)甲烷潛力，為厭氧消化技術(shù)的進(jìn)步奠定基礎(chǔ)。

但這些都還只是理論上的研究，目前并沒有一款以甲烷八疊球菌為唯一產(chǎn)甲烷菌的厭氧消化器投入到實(shí)際生產(chǎn)中，因此這也是亟待進(jìn)一步研究的方向。

[1]Holm－Nielsen J B，Al Seadi T，Oleskowicz－Popiel P.The future of anaerobic digestion and biogas utilization[J］.Bioresource Technology，2009，100（22）：5478－5484.

[2]Wijekoon K C，Visvanathan C，Abeynayaka A.Effect of organic loading rate on VFA production，organic matter removal and microbial activity of a two－stage thermophilic anaerobic membrane bioreactor[J］.Bioresource Technology，2011，102（9）：5353－5360.

[3]McCarty P L，Smith D P.Anaerobic wastewater treatment[J］.Environmental Sci Technol，1986，20（12）：1200－1206.

[4]Harper S R，Polhland F G.Recent developments in hydrogen management during anaerobic biological wastewater treatment[J］.Biotechnol Bioeng，1986，28（4）：585－602.

[5]Lattinga G，van Velsen A F M，Hobma S W，et al.Use of the upflow sludge blanket（USB）reactor concept for biological wastewater treatment[J］.Biotechnol Bioeng，1980，22（4）：699－734.

[6]Staley B F，de los Reyes F L，Barlaz M A.Effect of spatial differences in microbial activity，pH，and substrate levels on methanogenesis initiation in refuse[J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77（7）：2381－2391.

[7]Hao L P，Lu F，He P J，et al.Predominant contribution of syntrophic acetate oxidation to thermophilic methane formation at high acetate concentrations[J］.Environmental Science and Technology，2011，45（2）：508－513.

[8]Qu X，Vavilin V A，Mazeas L，et al.Anaerobic biodegradation of cellulosic material：Batch experiments and modelling based on isotopic data and focusing on aceticlastic and non－aceticlastic methanogenesis[J］.Waste Management，2009，29（6）：1828－1837.

[9]Sehnellen C G T P.Onderzoekingen over de methehnellen，Onderzoekingen over de methaangisting[D］.Rotterdam：Technical University Delft，1947.

[10]Boone D R，Whitman W B，Rouvihre P.Diversity and taxonomy of methanogens[C］.In Ferry J G（ed.），Methanogenesis：Ecology，physiology，biochemistry，and genetics[A］.New York：Chapman ＆ Hall，1993：35－80.

[11]Qu X，Mazeas L，Vavilin V A，et al.Combined monitoring of changes in delta13CH4and archaeal community structure during mesophilic methanization of municipal solid waste[J］.FEMS Microbiol Ecol，2009，68（2）：236－245.

[12]Anderson K L，Apolinario E E，Sowers K R，et al.Desiccation as a long－term survival mechanism for the archaeon Methanosarcina barkeri[J］.Appl Environ Microbiol，2012，78（5）：1473－1479.

[13]Sowers K R，Boone J E，Gunsalus R P.Disaggregation of Methanosarcina spp.and growth as single cells at elevated osmolarity[J］.Appl Environ Microbiol，1993，59（11）：3832－3839.

[14]Galagan J E，Nusbaum C，Roy A，et al.The genome of M.acetivorans reveals extensive metabolic and physiological diversity[J］.Genome Res，2002，12（4）：532－542.

[15]Benedict M N，Gonnerman M C，Metcalf W W，et al.Genomescale metabolic reconstruction and hypothesis testing in the methanogenic archaeon Methanosarcina acetivorans C2A[J］.Bacteriol，2012，194（4）：855－865.

[16]Welander P V，Metcalf W W.Loss of the mtr operon in Methanosarcinablocks growth on methanol，but not methanogenesis，and reveals an unknown methanogenic pathway[J］.Proc Natl Acad Sci，2005，102（30）：10664－10669.

[17]Vepachedu V R，F(xiàn)erry J G.Role of the fused corrinoid／methyl transfer protein CmtA during CO－dependent growth of Methanosarcina acetivorans[J］.Bacteriol，2012，194（16）：4161－4168.

[18]Deppenmeier U，Johann A，Hartsch T，et al.The genome of Methanosarcina mazei：Evidence for lateral gene transfer between bacteria and archaea[J］.Mol Microbiol Biotechnol，2002，4（4）：453－461.

[19]Maeder D L，Anderson I，Brettin T S，et al.The Methanosarcina barkeri genome：Comparative analysis with Methanosarcina acetivorans and Methanosarcina mazei reveals extensive rearrangement within methanosarcinal genomes[J］.Bacteriol，2006，188（22）：7922－7931.

[20]Buan N，Kulkarni G，Metcalf W W.Genetic methods for Metha nosarcinaspecies[J］.Methods Enzymol，2011，494：23－42.

[21]Apolinario E E，Jackson K M，Sowers K R.Development of a plasmid－mediated reporter system for in vivo monitoring of gene expression in the archaeon Methanosarcina acetivorans[J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（8）：4914－4918.

[22]Guss A M，Rother M，Zhang J K，et al.New methods for tightly regulated gene expression and highly efficient chromosomal integration of cloned genes for Methanosarcinaspecies[J］.Archaea，2008，2（3）：193－203.

[23]Spanheimer R，Muller V.The molecular basis of salt adaptation in Methanosarcina mazei Go1[J］.Arch Microbiol，2008，190（3）：271－279.

[24]Chen Y，Cheng J J，Creamer K S.Inhibition of anaerobic digestion process：A review[J］.Bioresource Technology，2008，99（10）：4044－4064.

[25]Ma J X，Mungoni L J，Verstraete W，et al.Maximum removal rate of propionic acid as a sole carbon source in UASB reactors and the importance of the macro－and micro－nutrients stimulation[J］.Bioresource Technology，2009，100（14）：3477－3482.

[26]Shin S G，Zhou B W，Lee S，et al.Variations in methanogenic population structure under overloading of pre－acidified highstrength organic wastewaters[J］.Process Biochemistry，2011，46（4）：1035－1038.

[27]Thauer R K，Kaster A K，Seedorf H，et al.Methanogenic archaea：Ecologically relevant differences in energy conservation[J］.Nature Reviews Microbiology，2008，6（8）：579－591.

[28]De Vrieze J，Hennebel T，Boon N，et al.Methanosarcina：The rediscovered methanogen for heavy duty biomethanation[J］.Bioresour Technol，2012，112：1－9.

[29]Sasaki K，Hirano S，Morita M，et al.Bioelectrochemical system accelerates microbial growth and degradation of filter paper[J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2011，89（2）：449－455.

[30]Francoleon D R，Boontheung P，Yang Y，et al.S－layer，surfaceaccessible，and concanavalin A binding proteins of Methanosarcina acetivorans and Methanosarcina mazei[J］.Journal of Proteome Research，2009，8（4）：1972－1982.

[31]Demirel B，Scherer P.The roles of acetotrophic and hydrogenotrophic methanogens during anaerobic conversion of biomass to methane：A review[J］.Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2008，7（2）：173－190.

[32]Hattori S.Syntrophic acetate－oxidizing microbes in methanogenic environments[J］.Microbes and Environments，2008，23（2）：118－127.

[33]Sasaki D，Hori T，Haruta S，et al.Methanogenic pathway and community structure in a thermophilic anaerobic digestion process of organic solid waste[J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111（1）：41－46.

[34]Nettmann E，Bergmann I，Pramschufer S，et al.Polyphasic analyses of methanogenic archaeal communities in agricultural biogas plants[J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76（8）：2540－2548.

[35]Schnurer A，Nordberg A.Ammonia，a selective agent for methane production by syntrophic acetate oxidation at mesophilic temperature[J］.Water Science and Technology，2008，57（5）：735－740.