包云光，李小兵，趙 嬋

(金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

復(fù)方苯乙哌啶對大鼠腸傳輸功能、病理和神經(jīng)遞質(zhì)的遠(yuǎn)期影響

包云光，李小兵，趙 嬋

(金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000)

目的： 通過建立大鼠便秘模型，探討復(fù)方苯乙哌啶對大鼠腸傳輸功能、病理組織學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)的遠(yuǎn)期影響及其安全性。方法給健康Wistar大鼠飼喂含復(fù)方苯乙哌啶的混懸液為實(shí)驗(yàn)組，飼喂普通水作為對照。飼養(yǎng)90天后停藥1周，測定腸道傳輸功能；觀察結(jié)腸大體形態(tài)和病理組織學(xué)檢查；測定結(jié)腸黏膜NO、SP含量及VIP陽性細(xì)胞分布情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠日均糞便粒數(shù)小于對照組(P<0.001)；實(shí)驗(yàn)組大鼠首粒黑便排出時(shí)間慢于對照組 (P<0.05)。造模第5天、第90天2組間平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組大鼠結(jié)腸黏膜光鏡下病理組織學(xué)表現(xiàn)類似。結(jié)腸黏膜NO、SP含量、VIP陽性細(xì)胞分布2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論復(fù)方苯乙哌啶較長期使用可致腸道傳輸速度明顯減慢，造成頑固便秘, 但對腸黏膜組織病理及腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)NO、 SP、VIP的產(chǎn)生均無明顯遠(yuǎn)期影響。

復(fù)方苯乙哌啶；傳輸功能；病理；神經(jīng)遞質(zhì)；遠(yuǎn)期影響

Abstract: [Objective] This study was designed to evaluate long-term effects of diphenoxylate on the intestinal transport function, colonic histopathology and the neurotransmitter, and provide a basis for further evaluation of the safety of its clinical application. [Method] Healthy Wister rats were divided randomly into control group and constipation group. In constipation group, the rats were daily administered diphenoxylate to develop slow transit constipated model, while the control rats taken without any drugs. The fecal number, fecal weight and body weight of rats were recorded. Transit functions of intestinal movement were examined. The levels of NO, SP were measured, and the distribution of VIP positive cells was observed. [Result]The fecal number daily in the constipated group was decreased significantly than that in controls (P<0.001). The time of discharge of the first black faeces ，significantly longer than that in controls (P<0.05). The average body weight on the first five days, the 90 days between the two groups had no significant difference. No obvious differences of colonic histopathologic manifestations were observed between the two groups. The differences of NO, SP levels and density of VIP positive cells in distal colonic segment between the two groups had not reached significance. [Conclusion]Diphenoxylate can slow intestinal transit function after longer-term administration, resulting in intractable constipation, but had no histopathological damage on the colonic mucosa，and had no significant long-term effects on the enteric nervous system of NO, SP, and VIP neurotransmitter production.

Keywords: diphenoxylate; intestinal transit function; pathology; neurotransmitters; long-term effects

復(fù)方苯乙哌啶(Diphenoxylate)為鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品復(fù)合制劑，主要作用于U型阿片受體，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，降低內(nèi)臟的敏感性，提高胃腸平滑肌的張力，其止瀉、緩解腹痛效果明顯，見效快，被臨床尤其基層廣泛應(yīng)用。長期服用可成癮,大劑量可致欣快感，過量可致嚴(yán)重的呼吸抑制和昏迷[1]。本研究通過建立大鼠模型，觀察體重、大便、病理組織學(xué)的變化，測定腸道傳輸功能和結(jié)腸黏膜NO、SP含量，及VIP的分布情況，以了解復(fù)方苯乙哌啶較長期使用對腸道傳輸功能、病理組織學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)、以及機(jī)體的遠(yuǎn)期影響，為進(jìn)一步評價(jià)其臨床應(yīng)用的安全性提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

32只健康Wistar大鼠，雄性，6～8周齡，體重110～130g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2007-0005，隨機(jī)分為對照組16只和實(shí)驗(yàn)組16只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型建立 大鼠模型建立參照劉海峰的方法[3]。大鼠分籠飼養(yǎng)，保持適宜環(huán)境，飼以普通級顆粒飼料。3天后開始建立模型，給實(shí)驗(yàn)組Wistar大鼠飼喂含復(fù)方苯乙哌啶(常州康普藥業(yè)有限公司生產(chǎn))混懸液，劑量8mg/kg·d，對照組飼喂自來水。每5日記錄一次大鼠大便粒數(shù)、干重及大鼠體重。飼養(yǎng)90天。

1.2.2 腸道傳輸功能測定 采用活性炭灌胃法測定首粒黑便排出時(shí)間。停藥1周的大鼠禁食24 小時(shí)，經(jīng)口灌入100g/L活性炭懸液2ml。從活性炭灌胃完畢開始計(jì)時(shí)，記錄從灌胃到首粒黑便排出時(shí)間。

1.2.3 結(jié)腸黏膜NO及SP測定 大鼠經(jīng)2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，通過腹正中切口，切取遠(yuǎn)段結(jié)腸，縱向剪開，在預(yù)冷的生理鹽水中清洗。經(jīng)液氮研磨制成10%(質(zhì)量體積比)勻漿低溫離心，留取上清液，-70℃保存待測。NO測定采用硝酸還原酶法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。SP用雙抗體夾心ELISA法檢測，試劑盒購自Rapid Bio Lab。

1.2.4 HE染色和免疫組化染色 剪取大鼠結(jié)腸遠(yuǎn)段約1cm，縱行剖開，生理鹽水漂洗后，固定于10%甲醛溶液，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片，分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。免疫組化試劑盒購自DAKO公司。VIP為武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品BA-0134； PBS代替一抗為空白對照；結(jié)果：陽性為黃色或黃棕色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.5 VIP計(jì)分標(biāo)準(zhǔn) (1)陽性染色細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的多少計(jì)分為A：沒有陽性染色細(xì)胞記為-；陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<25%為+；25～50%為++；>50%為+++；(2)按著色細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分為B：細(xì)胞呈陰性染色為-；染色弱，陽性細(xì)胞呈淡黃色為+；染色中等，陽性細(xì)胞呈棕黃色為++；染色強(qiáng)，陽性細(xì)胞呈棕褐色為+++。A和B相加作為判斷結(jié)果，再做分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠糞便粒數(shù)、每日糞便質(zhì)量及大鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)組大鼠日均糞便粒數(shù)小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。而日均糞便干重在2組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模第5天2組間的平均體重和造模第90天2組間的平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道傳輸速度與對照組相比明顯減慢，首粒黑便排出時(shí)間延長，分別為(430.2±132.1)min和(337.2±74.7)min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.450，P<0.05)。

表1 造模大鼠糞便粒數(shù)、干重及體重變化

2.2 大鼠結(jié)腸大體形態(tài)觀察和病理組織學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸較對照組粗大、迂曲。結(jié)腸黏膜HE染色顯示上皮細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿為淡紅色。部分有少量炎癥細(xì)胞浸潤、淋巴細(xì)胞聚集等，偶有上皮細(xì)胞脫落，未見明顯潰瘍，2組大鼠結(jié)腸黏膜光鏡下病理組織學(xué)表現(xiàn)相類似。

2.3 結(jié)腸遠(yuǎn)段黏膜神經(jīng)遞質(zhì)含量變化

遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜NO含量和SP水平在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜VIP陽性細(xì)胞分布在2組間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表2 造模大鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸黏膜NO及SP的變化

表3造模大鼠遠(yuǎn)段結(jié)腸黏膜VIP計(jì)分結(jié)果[累加例數(shù)(%)]

VIP計(jì)分(陽性細(xì)胞數(shù)+染色強(qiáng)度)++～+++++合計(jì)對照組19(59.4)4(12.5)9(28.1)32實(shí)驗(yàn)組21(65.6)4(12.5)7(21.9)32

χ2=0.350，P=0.839

2.4 結(jié)腸黏膜NO與NOS含量變化

除了近段結(jié)腸黏膜nNOS水平，近端、中段結(jié)腸黏膜NO含量、nNOS mRNA表達(dá)水平在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜NO含量、nNOS mRNA表達(dá)水平、eNOS陽性細(xì)胞分布在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 大鼠結(jié)腸黏膜NO ( umol/g protein)、nNOS mRNA(△Ct)和eNOS陽性細(xì)胞積分變化

3 討論

復(fù)方苯乙哌啶是非特異性止瀉藥，直接作用于腸平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器，減弱腸蠕動(dòng)，并使腸內(nèi)容物通過延遲，而致便秘[4]。通過飼喂復(fù)方苯乙哌啶，90天后大鼠結(jié)腸大體形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸較對照組粗大、迂曲，腸腔內(nèi)有較大塊的糞便存留，腸道傳輸時(shí)間顯著延長。2組大鼠結(jié)腸黏膜光鏡下病理組織學(xué)表現(xiàn)相類似。造模第5天2組間的平均體重和造模第90天2組間的平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯示較長期使用復(fù)方苯乙哌啶可致胃腸動(dòng)力功能障礙，腸內(nèi)容物滯留于結(jié)腸而引起頑固性便秘，與臨床上STC的病理生理過程相類似。但不產(chǎn)生病理組織學(xué)損害，不造成體重丟失。

研究表明，胃腸動(dòng)力功能障礙可能與ENS及其遞質(zhì)的異常變化有關(guān)[2, 4]。ENS由胃腸道、膽胰系統(tǒng)中所含的神經(jīng)節(jié)間網(wǎng)絡(luò)組成，對胃腸運(yùn)動(dòng)的興奮、調(diào)節(jié)和抑制起重要作用。ENS具有復(fù)雜多樣的神經(jīng)遞質(zhì)， 通過對其興奮性遞質(zhì)和抑制性遞質(zhì)的調(diào)控而達(dá)到調(diào)節(jié)功能的目的?，F(xiàn)已證實(shí)，NO是胃腸道主要的抑制性NANC遞質(zhì)[5-6]。當(dāng)NANC能神經(jīng)受到刺激時(shí)，即釋放NO，使其第二信使環(huán)磷酸鳥苷增多，胞漿Ca2+外流并抑制Ca2+內(nèi)流，致使胞漿游離Ca2+濃度降低，平滑肌舒張，胃腸運(yùn)動(dòng)減弱。有報(bào)道成人功能性便秘患者結(jié)腸粘膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量和密度均較正常組明顯增多、增強(qiáng)，粘膜內(nèi)NO生成量增加[7]。本研究顯示實(shí)驗(yàn)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜NO含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[8]，其原因尚不清楚。

VIP在胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中主要起抑制效應(yīng)，可通過直接作用于胃腸平滑肌上的VIP受體發(fā)揮作用，能引起人結(jié)腸平滑肌的舒張[2]。主要支配結(jié)腸下行性抑制反射，與結(jié)腸節(jié)段非推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)有關(guān)，它的減少會導(dǎo)致結(jié)腸節(jié)段非推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)增多，使結(jié)腸出現(xiàn)過度的節(jié)段性蠕動(dòng)，這些腸段的緊縮甚至痙攣使有效推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)減弱。我們利用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，VIP陽性神經(jīng)纖維在實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸黏膜的分布與對照組無明顯差異。這與文獻(xiàn)資料關(guān)于VIP能神經(jīng)在便秘患者結(jié)腸壁內(nèi)減少似有不符合之處[8]。

SP是興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元遞質(zhì)，主要存在于肌間神經(jīng)叢，能抑制胃腸道黏膜分泌，刺激腸道運(yùn)動(dòng)。慢傳輸型便秘患兒腹腔鏡結(jié)腸活檢，免疫熒光染色法測定，發(fā)現(xiàn)SP較正常兒童減少甚至缺乏[2]。本研究顯示遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜SP含量在實(shí)驗(yàn)組與對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道并不一致。

本研究表明，復(fù)方苯乙哌啶較長期使用可致腸道傳輸速度明顯減慢，出現(xiàn)結(jié)腸動(dòng)力減弱，造成便秘，但不產(chǎn)生病理組織學(xué)損害，不造成體重丟失。對腸神經(jīng)系統(tǒng)NO、 SP、VIP遞質(zhì)的產(chǎn)生也無明顯遠(yuǎn)期影響，其內(nèi)在的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

致謝：該研究得到浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院江米足教授和消化實(shí)驗(yàn)室大力支持、指導(dǎo)幫助，特別致謝。

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Long-term effects of diphenoxylate on the intestinal transit function, colonic histopathology and neurotransmitter in Wister rat

BAO Yunguang, LI Xiaobing, ZHAO Chan

(Jinhua Central Hospital, Zhejiang 321000, China)

R333.3

A

1672-0024(2012)02-0043-04

包云光(1961-)，女，浙江東陽人，本科，主任醫(yī)師。研究方向：小兒消化

金華市與浙江大學(xué)科技合作專項(xiàng)資金資助(計(jì)劃編號:2005-1-303)