HPLC法同時測定秦艽中龍膽苦苷和牛膝中蛻皮甾酮的含量

阮洪生，苗晶囡，馬丁，劉樹民

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040；2．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院）

秦艽為龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall的干燥根，具有祛風(fēng)濕，清濕熱，止痹痛，退虛熱的功效，臨床用于風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)半身不遂，筋脈拘攣，骨節(jié)酸痛，濕熱黃疸，骨蒸潮熱，小兒疳積發(fā)熱[1]的治療。秦艽中主要成分是龍膽苦苷，其中龍膽苦苷含量最高可達18%[2]。該類成分具有保肝、益肝、抗炎鎮(zhèn)痛等活性[3-5]。牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl．的干燥根，具有逐瘀通經(jīng)，補肝腎，強筋骨，利尿通淋，引血下行的功效，臨床用于經(jīng)閉，痛經(jīng)，腰膝酸痛，筋骨無力，眩暈[1]等的治療。蛻皮甾酮為牛膝中主要活性成分，其作用與牛膝“補肝腎，強筋骨”的功效相吻合[6]。秦艽善祛風(fēng)濕通絡(luò)止痛，為祛風(fēng)濕之要藥，風(fēng)藥中之潤劑，三痹必用之品，風(fēng)濕痹痛無問新久、或偏寒偏熱，均可配伍應(yīng)用。牛膝既能補肝腎，強筋骨，又能通血脈而利關(guān)節(jié)，性善下行，治下半身腰膝關(guān)節(jié)酸痛為其專長。因此，在獨活寄生湯、身痛逐瘀湯、三痹湯、羌活湯等一系列治療痹證的常用方劑中，秦艽和牛膝是很重要的方藥組成。秦艽中龍膽苦苷和牛膝中蛻皮甾酮含量檢測方法文獻報道很多[7-10]，但對兩者同時檢測還未見報道。采用RP-HPLC法同時測定了秦艽中龍膽苦苷和牛膝中蛻皮甾酮含量，為治療痹癥藥物研究提供了可行的檢測標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，F(xiàn)A2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀（上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

對照品：龍膽苦苷（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0170，供含量測定用），蛻皮甾酮（中國藥品生物制品檢定所，批號：111638-200603，供含量測定用）。秦艽、牛膝飲片購于哈藥集團世一堂飲片廠，經(jīng)檢驗，均符合《中國藥典》2010年版一部規(guī)定。甲醇、乙腈為色譜純（DIMA，USA），其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品儲備液

精密稱取對照品龍膽苦苷5.0 mg、蛻皮甾酮2.5 mg，分別置25mL量瓶中，加甲醇適量溶解并定容，制得各對照品儲備液。依次精密吸取上述2個儲備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于同一25 mL量瓶中，以甲醇定容，即得。

2.1.2 供試品溶液

將秦艽和牛膝干燥、粉碎、過40目篩后，準確稱取秦艽和牛膝樣品2.0 g（比例為1∶3），置于250 mL干燥萃取瓶中，加60%的乙醇50 mL，在超聲波工作的狀態(tài)下，選取微波功率80W，提取時間10 min的條件下進行超聲-微波協(xié)同萃取，提取液減壓回收，殘渣干燥后加甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，搖勻，用0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，4℃冰箱避光、密封保存[11]。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.2.1 色譜條件[12]

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B）進行梯度洗脫，0～10 min，流動相A∶B（30∶70）；10～13 min，流動相A∶B（68∶32）；13～25 min，流動相A∶B（30∶70）。流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量10μL。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷計不低于2 000，按β-蛻皮甾酮計不低于3 000。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗

按“2.2.1”項下的色譜條件，精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各1 010μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果對照品、供試品溶液色譜圖中龍膽苦苷、蛻皮甾酮均達到基線分離。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.龍膽苦苷對照品；B.蛻皮甾酮對照品；C.樣品Fig.1 HPLCChromatrograms of reference substances（A、B）and sample（C）

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品儲備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，甲醇定容，制成系列對照品溶液。按“2.2.1”項下的色譜條件測定峰面積，以溶液濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，龍膽苦苷和蛻皮甾酮的線性回歸方程分別為:

結(jié)果表明，龍膽苦苷和蛻皮甾酮進樣濃度分別在0.80～20.00，0.40～10.00μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度實驗

精密吸取同一混合對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次進樣10μL。記算龍膽苦苷和蛻皮甾酮峰面積積分值，RSD分別為0.43%和0.91%，結(jié)果表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h測定峰面積，龍膽苦苷和蛻皮甾酮的RSD分別為1.21%、1.43%（n=6）。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，結(jié)果龍膽苦苷和蛻皮甾酮平均含量分別為58.74 mg·g-1和1.56mg·g-1，RSD分別為1.32%和0.97%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品6份，每份約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入一定濃度的混合對照品溶液適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率。龍膽苦苷和蛻皮甾酮的平均回收率（n=6）分別為100.02%和99.95%，RSD分別為0.87%和1.02%。

2.8 樣品含量測定

按“2.1.2”項下方法，取6批供試品，每批樣品平行制備3份供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖。采用外標法分別計算龍膽苦苷和蛻皮甾酮的含量。結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果（n=6）Table1 Test results of samples

3 討論

3.1 提取方法的選擇

考察了回流提取法、索氏提取法、超聲提取法及超聲-微波協(xié)同萃取法4種不同提取方法，結(jié)果超聲-微波協(xié)同萃取法提取率高，且操作簡便省時。在水，甲醇、40%乙醇、60%乙醇、95%乙醇作為溶劑的比較試驗中，結(jié)果60%乙醇的提取率高，而且對被測兩組份的干擾較小。

3.2 流動相的選擇

分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水溶液等不同的流動相系統(tǒng)。結(jié)果以乙腈-0.1%醋酸水溶液系統(tǒng)，基線平穩(wěn)，峰形及分離好。在實驗中，采用等度洗脫保留時間較長且分離度較差，選擇梯度洗脫龍膽苦苷和蛻皮甾酮可以有效分離，色譜峰沒有干擾。

3.3 檢測波長的選擇

藥典中關(guān)于秦艽含量測定龍膽苦苷選擇的波長是254 nm，牛膝含量測定中蛻皮甾酮選擇的波長是250 nm。經(jīng)PAD全波長掃描后，查看三維圖譜，確定待測的龍膽苦苷和蛻皮甾酮在254 nm處有最大吸收，且其色譜峰表觀豐度高，基線平穩(wěn)，因此選擇254 nm作為檢測波長。

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