溫莪術(shù)不同溶劑提取物體外抗氧化活性評價

婁依依，向 錚，陳瑞峰，李麗麗，高紅昌*，李校堃

(溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫州 325035)

溫莪術(shù)不同溶劑提取物體外抗氧化活性評價

婁依依，向 錚，陳瑞峰，李麗麗，高紅昌*，李校堃

(溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫州 325035)

目的：探討溫莪術(shù)不同溶劑提取物體外的抗氧化活性。方法：分別用蒸餾水、95%乙醇、乙酸乙酯等不同極性溶劑提取溫莪術(shù)中活性物質(zhì)，采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羥自由基(·OH)、亞鐵離子螯合和還原能力等方法考察溫莪術(shù)不同提取物的抗氧化活性。同時用Folin-Cioeaile法測定不同提取物中的總酚含量，考察總酚含量與抗氧化清除率的關(guān)系。結(jié)果：DPPH自由基、·OH清除能力及還原能力結(jié)果表明95%乙醇及乙酸乙酯提取物在較低的質(zhì)量濃度顯示了較高的清除率；同時總酚含量測定結(jié)果顯示95%乙醇和乙酸乙酯提取物所含總酚含量較高，這表明這兩種溶劑提取物的抗氧化性與其提取物含有較高的酚類密切相關(guān)；亞鐵離子螯合實驗結(jié)果顯示水提物的螯合效果優(yōu)于其他溶劑提取物。結(jié)論：不同溶劑提取物抗氧化能力差別較大，總酚含量與抗氧化清除率具有相關(guān)性。

溫莪術(shù)；DPPH自由基；羥自由基；亞鐵離子螯合；還原能力；Folin-Cioeaile

人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧/氮是許多老年性疾病產(chǎn)生的重要原因，例如癌癥、動脈粥樣硬化、心血管疾病、免疫系統(tǒng)衰退及大腦功能障礙等疾病都與人體產(chǎn)生的活性氧自由基密切相關(guān)[1]。人體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，如超氧陰離子自由基(O2·)、羥自由基(·OH)、過氧化氫自由基等，它們具有強氧化性，損害機體的組織和細胞[2]。有報道稱，一些蔬菜和水果可以降低老年性疾病的發(fā)生率和死亡率，這可能與它們含有的抗氧化成分有關(guān)[3]。目前大部分人工合成抗氧化劑如丁羥苯甲醚(BHA)和丁羥甲苯(BHT)作為食品添加劑使用。近年來，世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)、歐共體兒童保護組織(HACSG)、日本、美國政府和相關(guān)國際組織的研究表明，合成抗氧化劑存在諸多副作用，如對人體的肝、脾、肺均有不利影響，甚至會誘發(fā)惡性腫瘤等[4]，因此美國食品藥品管理局(FDA)建議在一般認為安全的物質(zhì)中刪去BHT；日本衛(wèi)生部門也曾禁止使用BHA。事實也表明，在人們長期食用的食品中，天然抗氧化劑成分的毒性遠遠低于人工合成抗氧化劑的毒性。因此，近年來從自然界尋求天然、安全的抗氧化劑已引起各國科學家的高度重視。

溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金(Curcuma wenyujin)的根莖，是著名的浙八味之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，溫莪術(shù)中主要成分之一姜黃素能有效抑制糖尿病大鼠的脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化，改變其抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激對糖尿病的影響[5]；姜黃根莖己烷及水提物在清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基上表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[6-7]；蓬莪術(shù)揮發(fā)油也具有較好的清除DPPH自由基能力和抑制脂質(zhì)過氧化作用[8]；莪術(shù)多糖對·OH和O2·有一定的清除作用，且能顯著增加SOD的活性[9]。溫莪術(shù)與姜黃、蓬莪術(shù)同屬姜科植物，且含有較多的姜黃素、莪術(shù)多糖等成分，因此有必要研究其抗氧化能力以考察其在食品工業(yè)中的應(yīng)用潛力。本實驗運用DPPH自由基、Fenton、亞鐵離子螯合和Fe3+還原等方法考察溫莪術(shù)不同極性溶劑提取物體外抗氧化能力，為從溫莪術(shù)中提取天然安全的抗氧化活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溫莪術(shù)藥材于2010年1月采自溫州瑞安沙洲溫郁金GAP示范基地，經(jīng)溫州醫(yī)學院藥學院中藥學教研室鑒定為姜科植物溫郁金(Curcuma wenyujin)的干燥根莖，藥名為溫莪術(shù)。

沒食子酸對照品(純度≥98%) 中國藥品生物制品檢定所； Folin-Ciocalteu、丁羥基茴香醚(BHA)、亞鐵嗪、脫氧核糖 美國Sigma公司；FeSO4·7H2O、鐵氰化鉀、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯醋酸、氯化鐵、H2O2、硫代巴比妥酸(均為國產(chǎn)分析純試劑) 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2/M2e多功能酶標儀 美國分子儀器公司；AL204精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；BUCHI R205-V800旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；SK8210HP超聲波振蕩儀 上海科導超聲儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學儀器廠。

1.3 提取與制備

溫莪術(shù)干燥粉碎，取25g，分別用蒸餾水、95%乙醇、乙酸乙酯各100mL索氏提取4h(煮沸后)。減壓濃縮至10mL，得到不同溶劑提取物。置于－4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總酚含量測定[10]

總酚含量用Folin-Ciocalteu試劑測定。標準液的配制：準確稱取2.5mg沒食子酸標準品，蒸餾水溶解并定容至25mL，得質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的標準液。

標準曲線的建立：分別準確量取上述標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL棕色容量瓶中，加6mL水，搖勻，再加0.5mL Folin-Ciocalteu試劑，充分搖勻。1min后，加入1.5mL 20g/100mL Na2CO3溶液，混勻定容，室溫下反應(yīng)2h(避光)。得沒食子酸質(zhì)量濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010mg/mL的對照品溶液，于波長760nm波長處檢測，以蒸餾水為空白，用吸光度對沒食子酸質(zhì)量濃度繪制標準曲線，得回歸方程。

樣品的測定：用移液槍移取制備好的樣品溶液1mL于10mL容量瓶中，加6mL水，搖勻，再加0.5mL Folin-Ciocalteu試劑，充分搖勻。1min后，加入1.5mL 20g/100mL Na2CO3溶液，混勻定容，室溫下反應(yīng)2h(避光)，于760nm波長處測定樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線得出相應(yīng)的沒食子酸質(zhì)量濃度，按式(1)計算出樣品中總酚的含量，結(jié)果用mg 沒食子酸/g(以干基計)表示。

式中：C為總酚含量/(mg/g)；ρ為沒食子酸質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為取樣體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品總的取樣量/g。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 清除DPPH自由基測定[8]

2mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液 (0～40mg/mL) 與1mL 0.2mmol/L DPPH甲醇溶液混合，劇烈振蕩后置暗處30min，在517nm波長處測得樣品吸光度。以樣品本身溶劑為空白樣本，每個樣品質(zhì)量濃度平行3次，取平均值。以丁羥基茴香醚(BHA)為陽性對照，對DPPH自由基的清除率按式(2)計算。

式中：A0為空白樣本吸光度；A1為測試樣本吸光度。

EC50值定義為清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度，其計算是通過獲得的抑制DPPH自由基回歸方程所得。

1.5.2 清除·OH測定[11]

取0.2mL 3mmol/L FeSO4-EDTA混合液于試管中，依次加入0.5mL 5mmol/L 脫氧核糖，1.5mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液 (0～5mg/mL)，0.6mL 20mmol/L pH 7.4 磷酸緩沖液(PBS)，0.2mL 3mmol/L H2O2，混合均勻后置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)1h，然后加入1mL 2.8g/100mL三氯醋酸(TCA)溶液和1mL 1%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混勻后置于沸水浴中反應(yīng)15min，冷卻后于波長532nm處測得樣品吸光度。以樣品本身溶劑為空白樣本，每個樣品平行3次，取平均值。以丁羥基茴香醚(BHA)為陽性對照，對·OH的清除率按式(2)計算。

1.5.3 亞鐵離子螯合實驗[12]

1mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液 (0～40mg/mL) 與3.7mL甲醇和0.1mL 2mmol/L FeSO4·7H2O混合，反應(yīng)30s后，加入0.1mL 5mmol/L 亞鐵嗪，混合均勻后室溫下反應(yīng)10min，在波長562nm處測得樣品吸光度。以樣品本身溶劑為空白樣本，每個樣品平行3次，取平均值。以乙二胺四乙酸(EDTA)為陽性對照，對亞鐵的螯合率按式(3)計算。

式中：A0為空白樣本吸光度；A1為測試樣本吸光度。

1.5.4 Fe3+還原力實驗[13]

于試管中依次加入2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，2.5mL 200mmol/L、pH 6.6的磷酸緩沖液，2.5mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液(0～10mg/mL)，混合均勻后置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)20min，快速冷卻，加入2.5mL 10%三氯醋酸溶液，充分混勻在3000r/min離心10min，取5mL上清液與等量的蒸餾水，1mL 0.1%氯化鐵溶液混勻，10min后于700nm波長處測得樣品吸光度，吸光度越大則還原能力越強。以樣品本身溶劑為空白樣本，每個樣品平行3次，取平均值。以丁羥基茴香醚(BHA)為陽性對照。

1.6 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，重復實驗所得數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析，結(jié)果以表示。抗氧化活性和總酚含量間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量測定

圖1 不同溶劑提取物的總酚含量Fig.1 Total phenol contents in different solvent extracts from C. wenyujin root tubers

以吸光度為縱坐標，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，建立標準曲線。 結(jié)果表明，沒食子酸在質(zhì)量濃度0～0.01mg/mL內(nèi)與其吸光度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=43.0230X+0.0024(R2=0.9998)。

由圖1可知，溫莪術(shù)提取物的總酚含量隨提取溶劑的不同而有所變化。95%乙醇提取物的總酚含量最高(3.11mg/g)，水提取物的總酚含量最低(0.84mg/g)。

2.2 溫莪術(shù)提取物對DPPH自由基及·OH的清除作用

圖2 不同溶劑提取物對DPPH自由基(A)及·OH(B)的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of different extracts from C. wenyujin root tubers against DPPH and hydroxyl free radicals

DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于篩選蔬菜水果、植物提取物及食品的體外抗氧化活性[14]。由圖2A可知，不同極性提取物對DPPH自由基表現(xiàn)出的清除能力強弱不一，其中95%乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力最強。在0～5mg/mL時，BHA的清除能力要遠遠大于3種提取物；當質(zhì)量濃度升高到10mg/mL時，95%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率達到了95%，且高于BHA；乙酸乙酯提取物的清除能力稍低于95%乙醇，但比水提取物高。各提取物及BHA的EC50值范圍為0.004～20.856mg/mL。95%乙醇提取物的EC50值要小于其他提取物，且在高質(zhì)量濃度時，其對DPPH自由基的清除能力要比BHA好；水提物的EC50值最大。EC50值越大，表明清除能力越小。因此，各提取物對DPPH自由基的清除能力大小依次為：95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。

·OH是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基，具有攻擊大多數(shù)生物底物(如DNA、多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)等)的能力，會引起脂質(zhì)過氧化作用及造成生物損傷[15-16]。由圖2B可知，在較低質(zhì)量濃度下，95%乙醇和乙酸乙酯提取物均對·OH均表現(xiàn)出較好的清除能力，稍低于BHA。95%乙醇提取物在0.5mg/mL時清除率達到了85%；乙酸乙酯提取物清除能力在0～2mg/mL稍低于95%乙醇提取物，但在2～5mg/mL與95%乙醇提取物清除能力相當，均遠高于水提取物。各提取物及BHA的EC50值范圍為0.003～6.948mg/mL。95%乙醇提取物與乙酸乙酯提取物的EC50值相近，但高于BHA；水提取物的EC50值最大。因此，各提取物對·OH清除能力大小依次為： 95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。

2.3 溫莪術(shù)提取物對亞鐵離子的螯合作用和對Fe3+還原力

圖3 不同溶劑提取物對亞鐵離子的螯合作用(A)及對鐵離子的還原能力(B)Fig.3 Ferrous ion-chelating capacity and reducing power of different extracts from C. wenyujin root tubers

鐵因其高反應(yīng)活性，被認為是脂質(zhì)氧化的重要促進劑。對亞鐵離子的螯合，可以保護因鐵引起的氧化損傷[17]。由圖3A可知，各提取物中只有水提取物對亞鐵離子表現(xiàn)出較好的螯合作用，95%乙醇及乙酸乙酯提取物幾乎沒有作用。這可能與水提取物中含有較多的多糖類等水溶性成分有關(guān)。有研究表明，多糖能通過與產(chǎn)生活性氧(ROS)所必需的金屬離子發(fā)生螯合作用，對ROS起間接清除作用，從而達到抗氧化目的[18]。

還原能力的測定可檢驗化合物是否為良好的電子供體，體系中Fe3+還原為Fe2+，使溶液顏色從黃色變?yōu)榫G色，即表明體系中的氧化還原狀態(tài)。吸光度越大，還原力越強，抗氧化效果越好。由圖3B可知，BHA在極低的質(zhì)量濃度下就有較好的還原能力；95%乙醇和乙酸乙酯提取物的還原能力相近，均遠高于水提取物；并且在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3種提取物均表現(xiàn)出一定程度的量效關(guān)系。各提取物的還原能力大小依次為：乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物。

2.4 溫莪術(shù)提取物抗氧化活性和總酚含量間的相關(guān)性

抗氧化活性和總酚含量的相關(guān)性采用SPSS軟件中的Spearman秩相關(guān)進行分析，結(jié)果顯示兩者的相關(guān)系數(shù)為0.792(P＜0.01)，這表明溫莪術(shù)各提取物抗氧化活性的強弱與其酚類含量有著顯著的相關(guān)性，即提取物中總酚含量的多少直接反映了提取物的抗氧化能力的強弱。95%乙醇及乙酸乙酯提取物總酚含量較高，因此也具有較高的抗氧化活性。這可能主要是由于這兩種提取物中含有較多的酚類化合物。酚類是植物抗氧化活性的主要化合物之一，已有報道指出，不同蔬菜提取物中酚類含量與抗氧化活性有著顯著的相關(guān)性[19]。酚類化合物的抗氧化活性主要是由于其氧化還原性質(zhì)[20]，酚類化合物具有較強的清除自由基能力，是通過提供氫原子作為自由基的受體，以此阻斷連鎖氧化反應(yīng)來達到抗氧化作用[21]。

3 結(jié) 論

4種體外抗氧化活性評價方法的結(jié)果表明，在同一個抗氧化評價方法中，不同溶劑提取物的抗氧化能力存在較大差異。從DPPH自由基和·OH的清除率和EC50值看，溫莪術(shù)各提取物對·OH的清除作用優(yōu)于DPPH自由基，其中95%乙醇和乙酸乙酯提取物有較強的清除能力，水提取物的清除能力相對較弱；在還原能力大小的測定實驗中，95%乙醇與乙酸乙酯提取物的還原能力高于水提取物的還原能力；而在亞鐵離子螯合實驗中，水提取物的螯合能力則遠比其他兩者都要強，并在一定程度上高于陽性對照EDTA。此外，總酚含量測定結(jié)果顯示，95%乙醇及乙酸乙酯提取物的總酚含量高于水提物，各提取物抗氧化活性的強弱與其酚類含量相關(guān)性進行分析，證實兩者具有顯著的相關(guān)性，這也說明酚類是植物抗氧化活性的化合物之一。

隨著社會的發(fā)展，人們越來越注重自身的健康和食品的營養(yǎng)，合成抗氧化劑因其潛在的毒副作用對人類的安全造成威脅，而植物提取物因其天然、安全受到人們的青睞。研究表明溫莪術(shù)95%乙醇及乙酸乙酯提取物中的活性組分在較低的質(zhì)量濃度時具有較好的抗氧化活性，能有效清除各種自由基，這表明其提取物中可能含有具有延緩機體衰老、預防心血管疾病的活性成分，這為溫莪術(shù)開發(fā)其藥用保健價值提供了重要參考。

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Antioxidant Activitiesin vitroof Different Solvent Extracts fromCurcuma wenyujinRoot Tubers

LOU Yi-yi，XIANG Zheng，CHEN Rui-feng，LI Li-li，GAO Hong-chang*，LI Xiao-kun
(Pharmacy School, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, China)

Objective∶ To explore thein vitroantioxidant activities of different solvent extracts from the root tubers ofC. wenyujin.Methods∶ The root tubers ofC. wenyujinwere extracted with solvents of different polarity, such as distilled water, 95% ethanol and ethyl acetate, respectively. The resulting extracts were assessed for antioxidant properties, such as DPPH free radical scavenging activity, hydroxyl free radical scavenging activity, ferrous ion-chelating capacity and reducing power. Meanwhile,the total phenol contents of the extracts were determined by the Folin-Ciocaile method and the correlation between total phenol content and antioxidant properties was analyzed. Results∶ The 95% ethanol and ethyl acetate extracts showed high free radical scavenging activity at low concentrations and had higher total phenol content than the distilled water extract. Therefore, the powerful antioxidant activity of the 95% ethanol and ethyl acetate extracts is immediately linked to their higher total phenol content. However, their ferrous ion-chelating capacity was inferior to that of the distilled water extract. Conclusions∶ The different solvent extracts from the root tubers ofC. wenyujinshow a considerable difference in their antioxidant activities and a correlation between their total phenol content and antioxidant properties.

Curcuma wenyujin；DPPH free radical；hydroxyl radicals；ferrous ion-chelating capacity；reducing power；Folin-Cioeaile method

Q949.71

A

1002-6630(2012)03-0039-05

2011-02-22

溫州醫(yī)學院科研啟動經(jīng)費項目(QTJ08008)；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目(2009YB021；2010ZB087)

婁依依(1987—)，女，碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究。E-mail：yi1987yi@yahoo.com.cn

*通信作者：高紅昌(1979—)，男，副教授，博士，主要從事中醫(yī)藥的代謝組學研究。E-mail：gaohc27@gmail.com