郭文婧，邵 青，張玉峰，范驍輝

(浙江大學藥物信息學研究所，浙江杭州 310058)

生脈方源于張元素的《醫(yī)學啟源》，由人參、麥冬、五味子(北)組成，具有益氣生津，斂陰止汗之功效，用于心腦血管疾?。?-2］。生脈方主要含有人參皂苷Rb1、Rg1等二醇型、三醇型人參皂苷類及五味子醇甲等木脂素類活性成分［3-6］。以往文獻報道的有關(guān)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和五味子醇甲的藥代動力學研究，主要是圍繞三七總皂苷、五味子藥材提取物、生脈制劑及其單體化合物開展的［7-13］，而以生脈方中人參皂苷二醇型、三醇型和木脂素類化合物為研究對象，觀測生脈方中不同類型化合物配伍對其藥動學行為的影響尚未見報道。中醫(yī)臨床用藥的主要形式是方劑，通過配伍組方達到增效、減毒等目的。已有文獻大多從方劑藥材單煎、合煎提取角度研究中藥復方中化學成分遷移、變化來研究方劑配伍的合理性［14］，有文獻報道，生脈方合煎后產(chǎn)生的新物質(zhì)對復方整體療效是有利的［15］。但是，藥物是通過吸收入血才能真正發(fā)揮作用。為此，本研究以生脈方中不同類型化合物為研究對象，考察伍用前后藥動參數(shù)的差異，從藥代動力學的視角詮釋了配伍的科學性。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1100液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧接口、四極桿質(zhì)譜，Chemstation色譜數(shù)據(jù)工作站(美國Agilent公司);SDP121P型離心濃縮儀(美國Thermo公司);Mini span離心機(德國Eppendorf公司);渦旋震蕩器(德國IKA公司);分析天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 藥品與試劑 人參皂苷 Rg1(批號:101206)、人參皂苷Rb1(批號:101029)和五味子醇甲(批號:100930)標準品均購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;地高辛標準品購于中國藥品生物制品檢定所，批號:100015-200308。乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)，冰乙酸(色譜純，美國 Tedia公司)，Milli-Q超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，體重為200～300 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2007-2005。

1.4 標準品儲備液、含內(nèi)標萃取液以及灌胃藥液的制備

1.4.1 標準品儲備液 取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲標準品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1.28 mg·ml-1、1.07 mg·ml-1和 1.02 mg·ml-1的標準品儲備液，4℃保存。

1.4.2 含內(nèi)標的萃取液 精密稱取地高辛標準品適量，用正丁醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.444 mg·ml-1的儲備液。臨用前用水飽和正丁醇稀釋成地高辛質(zhì)量濃度為35.5 ng·ml-1的萃取液。

1.4.3 灌胃藥液 精密稱取一定量人參皂苷Rg1、Rb1，分別用0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液超聲溶解，制成質(zhì)量濃度為5 mg·ml-1的單體灌胃溶液，另精密稱取一定量五味子醇甲，加0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液碾磨，制成質(zhì)量濃度為5 mg·ml-1的單體灌胃混懸液，同法制成各單體質(zhì)量濃度均為5 mg·ml-1的配伍灌胃混懸液。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥動學實驗方案 健康SD雄性大鼠24只，給藥前禁食12 h，不禁水，給藥4 h后自由飲水，12 h后進食。隨機分成4個給藥組:人參皂苷Rg1單體給藥組、人參皂苷Rb1單體給藥組、五味子醇甲單體給藥組以及三單體配伍給藥組。按100 mg·kg-1劑量灌胃給藥后，各組分別在 2、5、10、20、40、60 min 及 1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h 經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采靜脈血約0.5 ml。人參皂苷Rb1單體給藥組和配伍給藥組另在24、48和72 h 3個時間點采集血樣。分離血清，于-80℃冰箱保存、待測。

2.2 血清樣品處理方法 精密量取大鼠血清樣品 50μL，加入 milli-Q 超純水 50μL，渦旋混合10 s，精密加入含內(nèi)標的萃取液 1.5 ml，1 500 r·min-1渦旋震蕩萃取 20 min，12 000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液1.3 ml于2 ml離心管中，40℃離心濃縮干燥3 h以上，殘留物加70%甲醇50μL，超聲5 min溶解，1 500 r·min-1渦旋 10 min 混勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液待測。

2.3 生物樣品分析方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm × 100 mm，3.5 μm)。流動相:0.05%醋酸水溶液(A相)-0.05%醋酸乙腈(B相)，線性洗脫梯度:0 min 20%B，7 min 50%B，15 min 50%B，16 min 80%B，18 min 80%B。流速:0.3 ml·min-1;柱溫:40℃;進樣量:20μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，選擇離子監(jiān)測(SIM)模式:4～11 min負離子掃描，人參皂苷 Rg1的 m/z為 859、人參皂苷 Rb1的m/z為1107、地高辛的 m/z為 779，11 ～15 min正離子掃描，五味子醇甲的m/z為433;源內(nèi)裂解電壓:人參皂苷Rg1、Rb1、五味子醇甲和地高辛分別為200、350、60和300 V。毛細管電壓為4 500 V，霧化氣溫度為350℃，霧化氣流速為11 L·min-1，霧化壓力為 35 psi。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性試驗 取大鼠空白血清液、血清標準品液和配伍給藥后血清樣品液各50μL分別按2.2項下方法處理(空白血清液萃取改用水飽和的正丁醇液)，按2.3項下方法分析，記錄選擇離子流圖(圖1)，大鼠血清中內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲和內(nèi)標物的測定，方法專屬性良好。

2.4.2 線性與范圍、定量限和檢測限 精密量取各標準品儲備液適量，加甲醇制成混合標準品儲備液，再用甲醇稀釋混標儲備液制成系列濃度混標溶液，分別精密量取各混標溶液100μL，于2 ml離心管中離心、濃縮、干燥，并加入空白大鼠血清 50μL，超聲5min 溶解，按 2.2 項下方法操作，再按2.3項下方法分析。以血清中人參皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲的濃度為橫坐標，相應(yīng)標準品峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標進行線性回歸。人參皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲線性回歸方程分別為:Y=0.3137X+0.0157，R2=0.9984;Y=2.0997X+0.0965，R2=0.9929;Y=31.82X+0.4648，R2=0.9983。線性范圍分別為:0.0100 ～ 5.12、0.00502 ～2.57 和 0.00239 ～1.22 μg·ml-1。

按信噪比為10∶1計，血清中人參皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲的定量限為:10.0、5.02、2.39 ng·ml-1;按信噪比為3∶1計，血清中人參皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲的檢測限為:5.00、2.51、1.20 ng·ml-1。

2.4.3 回收率試驗 分別配制6份低、中、高3種濃度的血清標準品，按2.2項下方法操作，再按2.3項下方法分析，結(jié)果見表1。

表1 三種化合物的回收率Table 1 The results of recovery experiment(n=6)

圖1 大鼠血清、血清標準品和血清樣品液選擇離子色譜圖Fig.1 LC/MS SIM chromatograms of blank serum sample，serum sample spiked with standard and IS and serum sample

2.4.4 精密度試驗 分別配制6份低、中、高3種質(zhì)量濃度血清標準品，按2.2項下方法操作，再按2.3項下方法分析，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD分別為:人參皂苷Rg14.9%、4.1%、2.4%，人參皂苷 Rb14.1%、2.3%、3.9%，五味子醇甲1.5%、2.9%、5.0%，分別在6 d中配制6份低、中、高3種質(zhì)量濃度的血清標準品按上述方法處理、分析，結(jié)果日間精密度 RSD分別為:人參皂苷 Rg15.2%、6.3%、4.7%，人參皂苷 Rb16.8%、5.9%、3.9%，五味子醇甲13.0%、9.4%、3.6%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取中濃度血清標準品，按2.2 項下方法操作，分別于0、3、6、12、18、23 h進樣分析，考察室溫下生物樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果人參皂苷Rg1峰面積RSD為6.2%，人參皂苷Rb1峰面積 RSD為4.4%，五味子醇甲峰面積RSD為9.2%。分別取高、低濃度血清樣品-80℃保存0、2、3個月，考察生物樣本保存3個月內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果人參皂苷Rg1含量RSD為5.0%、6.7%，人參皂苷 Rb1含量 RSD 為10.7%、9.6%，五味子醇甲含量 RSD 為 2.8%、30.6%。

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng) 取大鼠空白血清50μL，加入 milli-Q 超純水50μL，渦旋混合 10 s，精密加入水飽和的正丁醇萃取液 1.5 ml，1 500 r·min-1渦旋震蕩萃取 20 min，12 000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液1.3 ml于2 ml離心管中，40℃離心濃縮干燥3 h以上，殘留物分別加70%甲醇為溶劑的低、中、高3種濃度混標溶液50μL超聲溶解，每種濃度平行做6份，按2.3項下方法分析，與對應(yīng)濃度的混標溶液比較，計算3種化合物在血清中的基質(zhì)效應(yīng)分別為:人參皂苷 Rg180.1% ～83.0%、人參皂苷Rb182.9% ～ 88.8%、五味子醇甲 61.2% ～78.9%。

2.5 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果 人參皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲平均血藥濃度-時間曲線見圖2。單體給藥組和配伍給藥組血藥濃度進行重復測量的方差分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1配伍前后差異有顯著性(P=0.035)，人參皂苷Rb1和五味子醇甲配伍前后差異無顯著性(P=0.875和0.820)。血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用WinNonLinu6.0藥動學軟件處理，以非房室模型計算，所得藥動學參數(shù)見表2～4。單體給藥和配伍給藥的藥動學參數(shù)采用t檢驗分析。本實驗設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 人參皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲血藥濃度-時間曲線圖Fig.2 The blood concentration-time profiles of ginsenosides Rg1，Rb1 and schisandrin

表2 人參皂苷Rg1藥動參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1(n=6)

表3 人參皂苷Rb1藥動參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rb1(n=6)

表4 五味子醇甲藥動參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of schisandrin (n=6)

3 討論

大鼠單體給藥和配伍給藥后獲取的藥動學參數(shù)表明:配伍給藥后人參皂苷Rg1的達峰濃度由(0.476 ±0.238)μg·ml-1上升為(1.95 ±1.43)μg·ml-1，AUC0-∞由(0.523 ± 0.238)μg·h·ml-1上升為(1.91 ±1.32)μg·h·ml-1，清除率由(226311 ± 96819)ml·h-1·kg-1下降為(90650 ±73684)ml·h-1·kg-1，表觀分布容積由(317110±154009)ml·kg-1下降為(130967±78306)ml·kg-1，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而人參皂苷Rb1、五味子醇甲的藥動參數(shù)伍用前后無明顯差異。配伍給藥后人參皂苷Rg1的生物利用度較單體給藥組有顯著提高，表明人參皂苷Rb1和五味子醇甲的存在促進了人參皂苷Rg1的吸收并降低了其消除。有文獻報道人參總皂苷給藥后人參皂苷Rg1在十二指腸和回腸中的吸收明顯好于單體給藥［16］，結(jié)合本研究結(jié)果，驗證了人參皂苷Rb1是促進人參皂苷Rg1吸收的重要成分之一。其改善吸收的機制有待進一步深入研究。人參皂苷Rg1、Rb1分屬三醇型和二醇型人參皂苷類，其藥動特性有很大差異，前者在體內(nèi)快速吸收和消除，而后者吸收和消除均較慢，其絕對生物利用度均較低。由于同類型皂苷的藥動特性相似，提示該類成分的合理伍用，有可能提高三醇型人參皂苷類的生物利用度，從而提高藥效。從藥代動力學的視角詮釋了配伍的科學性，也為有效組分配伍進行新藥研發(fā)提供科學依據(jù)。

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