骨質(zhì)疏松發(fā)病過(guò)程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞差異性表達(dá)microRNA的篩選及其在干細(xì)胞多向分化中的功能

廖 立，楊小紅，金 巖

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔組織病理學(xué)教研室，組織工程研發(fā)中心，陜西西安 710032;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，貴州遵義 563003)

雌激素、糖皮質(zhì)激素等全身性內(nèi)分泌激素能夠影響骨骼的改建。在絕經(jīng)期后女性超過(guò)50%患有不同程度的骨質(zhì)疏松［1］。骨質(zhì)疏松的發(fā)生現(xiàn)在認(rèn)同的觀點(diǎn)是在骨改建過(guò)程中成骨功能與破骨功能的失調(diào)所致。雌激素缺乏不僅能夠激活輔助 T細(xì)胞(T helper，Th)，而且能通過(guò)RANK/RANKL等途徑促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)破骨功能［2］;同時(shí)，雌激素缺乏也能夠抑制成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖和分化。有研究認(rèn)為，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSC)是成骨前體細(xì)胞的來(lái)源，具有雌激素受體，可以受到雌激素的直接作用，影響增殖和分化相關(guān)基因表達(dá);雌激素缺乏還可以活化輔助性T細(xì)胞，通過(guò)Fas/FasL信號(hào)途徑間接導(dǎo)致BMMSC的凋亡［3］。但是，相比于對(duì)破骨細(xì)胞的作用而言，此激素缺乏對(duì)于成骨相關(guān)細(xì)胞的作用機(jī)制仍不確定。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢切除(ovariectomy，OVX)小鼠骨質(zhì)疏松模型中BMMSC的分化能力發(fā)生了一定的改變。與假手術(shù)(sham surgery，Sham)小鼠相比，OVX小鼠BMMSC成骨分化能力減弱，而成脂分化能力增強(qiáng)，其細(xì)胞行為的改變與小鼠骨骼的病理表現(xiàn)相一致，提示BMMSC的功能異常在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。部分研究也支持此假設(shè)［4-5］。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn) OVX小鼠 BMMSC雖然在體外培養(yǎng)過(guò)程中使用了含雌激素的普通胎牛血清和培養(yǎng)基，但其分化功能卻仍存在缺陷，這說(shuō)明雌激素不僅通過(guò)外源性信號(hào)即時(shí)調(diào)控BMMSC的功能，雌激素長(zhǎng)時(shí)間的缺乏還能對(duì)BMMSC造成內(nèi)源性的損傷，且這種損傷在雌激素水平恢復(fù)至正常之后一定時(shí)期內(nèi)是無(wú)法完全恢復(fù)的。這與近年報(bào)道的雌激素缺乏后對(duì)乳腺干細(xì)胞造成的增殖能力損傷相類似［6-7］。然而，對(duì)于雌激素缺乏如何導(dǎo)致BMMSC功能異常的分子機(jī)制目前尚不明確。

近年來(lái)，microRNA逐漸成為研究的熱點(diǎn)，大量研究發(fā)現(xiàn)，其作為一種保守而普遍的調(diào)控機(jī)制，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用［8-10］。細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的改變將對(duì)干細(xì)胞的狀態(tài)和功能造成顯著的影響［11-12］。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種microRNA在BMMSC的分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［13-15］。所以，本研究假設(shè)在雌激素缺乏的條件下，可能導(dǎo)致 BMMSC內(nèi)部microRNA表達(dá)譜發(fā)生一定的改變，并通過(guò)調(diào)控分化相關(guān)靶基因而影響了BMMSC的正常分化，損害正常的成骨功能而導(dǎo)致或加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 OVX小鼠骨質(zhì)疏松模型的建立 C57BL/6J近交系小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買。取30只8周齡小鼠，隨機(jī)分為2組，以1%戊巴比妥鈉麻醉后，從背部開(kāi)口尋找到雙側(cè)卵巢，卵巢切除組(OVX)于子宮頸部結(jié)扎后切除卵巢，縫合傷口;假手術(shù)組(Sham)僅切除部分脂肪組織，保留卵巢，縫合傷口。置于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)3個(gè)月后，進(jìn)行股骨micro CT和組織學(xué)檢測(cè)，驗(yàn)證模型是否建立成功。

1.2 BMMSC體外培養(yǎng) C57BL/6J小鼠頸椎脫臼后剝?nèi)」晒羌懊劰?，剔除表面肌肉及軟組織，以1 ml針管沖洗骨髓后將細(xì)胞懸液接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的α-MEM培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每2天半量換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%后以2×104/cm2的密度傳代。

1.3 microRNA芯片篩選 取術(shù)后3個(gè)月OVX組及sham組小鼠各9只，分別分離股骨及脛骨后按上述方法常規(guī)培養(yǎng)BMMSC，待原代細(xì)胞密度達(dá)到80%后，使用細(xì)胞裂解液(LC公司)提取RNA行microRNA微陣列芯片檢測(cè)(LC-μParafloTM微流體芯片，杭州聯(lián)川生物信息技術(shù)有限公司)。

1.4 BMMSC的成骨成脂誘導(dǎo) 成骨成脂誘導(dǎo)及檢測(cè):成脂誘導(dǎo)液為α-MEM，加入10%胎牛血清(杭州四季青)，0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma)，2 μmol/L 胰島素(Sigma)和10 nmol/L地塞米松(Sigma)。成骨誘導(dǎo)液為α-MEM，加入10%胎牛血清(杭州四季青)，100 nmol/L地塞米松，5 mmol/L甘油磷酸鈉和50 μg/ml左旋維生素C(Sigma)。細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，待密度達(dá)到90%以后加入成脂誘導(dǎo)液和成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)。加入誘導(dǎo)液后分別于第1天、第7天和第14天以TRIZOL@Reagent(Invitrogen)提取 RNA。同時(shí)，分別對(duì)成骨及成脂誘導(dǎo)14 d后的BMMSC進(jìn)行茜素紅、油紅染色及相關(guān)基因(ALP、OCN、RUNX2、PPAR-γ、LPL)進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，驗(yàn)證成骨成脂誘導(dǎo)是否成功。

1.5 RT-PCR檢測(cè) 按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)，使用RT-PCR試劑盒(寶生物工程有限公司，Takara)對(duì)所提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并用ABI7500 RT-PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。其中microRNA RT-PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司訂制，其余mRNA RT-PCR引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松小鼠BMMSC的microRNA表達(dá)譜發(fā)生了改變 通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的原代小鼠BMMSC進(jìn)行 microRNA芯片篩查，發(fā)現(xiàn)在mirBase 16.0 數(shù)據(jù)庫(kù)(www.mirbase.org)中已發(fā)現(xiàn)的1032 microRNA中，有305種在BMMSC中表達(dá)。其中，第一組芯片中差異性表達(dá)的microRNA有34個(gè)，第二組芯片中差異性表達(dá)的microRNA有95個(gè)，第三組芯片中差異性表達(dá)的 microRNA有89個(gè)。但是，三組芯片中microRNA的差異并非完全一致，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，共有10個(gè)microRNA差異明顯(表1)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及三組芯片的一致性，選擇了5個(gè)microRNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，證明了芯片篩查結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性(圖1)。

表1 芯片篩查差異性表達(dá)microRNATable 1 The microRNA differentially expressed in micro-array chip

圖1 Sham組及OVX組BMMSC中microRNA表達(dá)水平Fig.1 The results of microRNA expression level of BMMSCs of Sham group and OVX group

2.2 部分差異性表達(dá)microRNA與BMMSC成骨分化過(guò)程密切相關(guān) 對(duì)BMMSC進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，從不同時(shí)間點(diǎn)采集細(xì)胞RNA樣本。誘導(dǎo)14 d后，通過(guò)茜素紅染色和RUNX2、ALP、OCN、COL-1基因表達(dá)及RT-PCR檢測(cè)證明成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確實(shí)成功(結(jié)果未展示)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)對(duì)部分篩選出的microRNA的表達(dá)產(chǎn)生了明顯的影響(表 2)。其中，miR-20a、miR-21、miR-29a、let-7a在成骨過(guò)程中均呈逐漸下降趨勢(shì)，成骨誘導(dǎo)14 d后，miR-29a降至誘導(dǎo)前水平的20%左右，miR-20a和let-7a降至原有水平的10%以下，miR-21在誘導(dǎo)第1天后出現(xiàn)一定的上升，隨后下降至誘導(dǎo)前水平的60%;而miR-680在成骨分化中呈上升趨勢(shì)，誘導(dǎo)14 d后較誘導(dǎo)前上升了約12倍。這些結(jié)果表明，上述microRNA與成骨分化過(guò)程密切相關(guān)，可能對(duì)分化中關(guān)鍵靶基因發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用，影響B(tài)MMSC的定向分化。但是，其變化趨勢(shì)與前期實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的骨質(zhì)疏松BMMSC的成骨能力下降不完全一致。

2.3 部分差異性表達(dá)microRNA與BMMSC成脂分化密切相關(guān) 對(duì)BMMSC進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，從不同時(shí)間點(diǎn)采集細(xì)胞RNA樣本。誘導(dǎo)14 d后，通過(guò)油紅染色和PPAR-γ、LPL基因表達(dá)，以及RT-PCR檢測(cè)，證明成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確實(shí)成功(結(jié)果未展示)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)microRNA的表達(dá)在成脂誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生了明顯變化(表3)。其中，miR-680在成脂過(guò)程中明顯上升，第14天時(shí)升高了約8倍。而miR-20a在成脂過(guò)程中呈持續(xù)性下降去勢(shì)，在誘導(dǎo)7 d后基本沒(méi)有表達(dá)，降至原有水平的1%以下。miR-29a于成脂誘導(dǎo)1 d時(shí)出現(xiàn)了一定程度的上調(diào)，但隨后明顯下調(diào)至原水平的10%左右。而miR-21和let-7a在不同樣本成脂誘導(dǎo)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中表達(dá)不穩(wěn)定，趨勢(shì)不明確(結(jié)果未展示)。這些結(jié)果均說(shuō)明上述microRNA與BMMSC成脂過(guò)程密切相關(guān)，且其變化趨勢(shì)與前期試驗(yàn)觀測(cè)到的骨質(zhì)疏松BMMSC的成脂功能增強(qiáng)相一致。

表2 成骨誘導(dǎo)過(guò)程中BMMSC的microRNA表達(dá)變化Table 2 The expression of microRNA in BMMSC during osteogenesis induction

表3 成脂誘導(dǎo)過(guò)程中BMMSC的microRNA表達(dá)變化Table 3 The expression of microRNA in BMMSC during adipogenesis induction

3 討論

本研究首次對(duì)雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松BMMSC的microRNA表達(dá)譜進(jìn)行微陣列芯片篩查，發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松下BMMSC microRNA表達(dá)譜發(fā)生了一定的改變。首先，特定的microRNA僅在特定的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在1 032種已知的小鼠microRNA中僅有305種在BMMSC中表達(dá)，且表達(dá)的豐度在不同來(lái)源BMMSC中相對(duì)一致，證明microRNA可以作為細(xì)胞的身份標(biāo)識(shí)［16］;同時(shí)，在芯片篩選結(jié)果中，多數(shù)microRNA的表達(dá)量改變不大，這與近期一些針對(duì)BMMSC進(jìn)行的microRNA芯片篩選結(jié)果類似［17-18］。這可能是因?yàn)樵谒ダ霞肮琴|(zhì)疏松等慢性退行性變中，BMMSC并未發(fā)生根本的分化或變異，只是功能發(fā)生了一定程度的改變，不同于腫瘤或者發(fā)育階段所發(fā)生的根本轉(zhuǎn)變時(shí)觀察到的microRNA表達(dá)譜的明顯變化。對(duì)于這種輕度的改變?nèi)绾物@著調(diào)控細(xì)胞的功能，可能是通過(guò)多個(gè)microRNA共同調(diào)控一個(gè)靶基因，或者是一個(gè)microRNA調(diào)控一組功能互相協(xié)同的microRNA 來(lái)實(shí)現(xiàn)的［19］。

通過(guò)對(duì)BMMSC進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)并對(duì)此過(guò)程中特定microRNA的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) miR-680、miR-20a、miR-29 在 2 種分化過(guò)程中都出現(xiàn)了明顯的變化，提示這些microRNA的表達(dá)變化與干細(xì)胞的分化密切相關(guān)。其中miR-680在成骨及成脂過(guò)程分化中均上升，提示miR-680可能調(diào)控了抑制細(xì)胞分化的靶基因，其升高使得這類抑制性靶基因下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的分化進(jìn)程;而miR-20a和miR-29a在成骨及成脂分化過(guò)程中均下降，提示其可能調(diào)控的是促進(jìn)細(xì)胞分化的靶基因，其下調(diào)使得對(duì)這些靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控減弱，促進(jìn)其表達(dá)，加快分化進(jìn)程。不過(guò)，增殖與分化是2個(gè)緊密聯(lián)系的細(xì)胞生命活動(dòng)，前期實(shí)驗(yàn)也提示干細(xì)胞在分化過(guò)程中增殖將受到明顯的抑制，所以也不排除這些microRNA可能與細(xì)胞的增殖相關(guān)，其影響的是細(xì)胞增殖能力的改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多個(gè)microRNA在成骨過(guò)程中的改變趨勢(shì)與其在骨質(zhì)疏松過(guò)程中的變化趨勢(shì)不一致;而成脂分化過(guò)程中的變化趨勢(shì)與骨質(zhì)疏松過(guò)程中的變化趨勢(shì)是一致的。這一方面可能是特定microRNA可以調(diào)控一系列的靶基因，從而與細(xì)胞多種功能相關(guān)，其在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的變化不一定單純反映BMMSC成骨分化功能的改變，也可能反映的是干細(xì)胞增殖、凋亡或者因子分泌功能的改變［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-335在成脂和成骨過(guò)程中均呈下降趨勢(shì)，而且其改變不僅對(duì)于細(xì)胞分化產(chǎn)生影響，還能夠同時(shí)影響細(xì)胞的增殖和遷移能力［20］。另一方面，因?yàn)锽MMSC成骨成脂這兩種分化方向處于一種互相拮抗的狀態(tài)，如果其成脂功能異常增強(qiáng)將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，而骨密度異常增高的患者表現(xiàn)出BMMSC的成脂能力缺陷。在成骨及成脂分化的過(guò)程中，例如RUNX2、PPAR-γ、TAZ等基因發(fā)揮著重要的開(kāi)關(guān)作用，能夠控制細(xì)胞的分化方向［20］。所以如果microRNA的靶基因是調(diào)控成脂分化的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)基因，那其在骨質(zhì)疏松狀態(tài)中的改變將對(duì)于BMMSC的成脂分化起到較強(qiáng)的促進(jìn)作用，控制其定向分化，這可能抵消此microRNA對(duì)于成骨分化的反向調(diào)節(jié)作用［5］。

我們通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件(TargetScan，PicTar，Miranda)對(duì)所選的差異性表達(dá)microRNA的功能進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)microRNA都能夠調(diào)控大量靶基因，其中部分基因與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)。這些基因互相聯(lián)系，形成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行精確調(diào)控［21］。由此可以提出一個(gè)假設(shè):雌激素通過(guò)直接或間接作用維持BMMSC內(nèi)部特定microRNA表達(dá)譜的穩(wěn)定，后者通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控控制一系列靶基因的表達(dá)穩(wěn)態(tài)，控制BMMSC正常的生物學(xué)行為，維持骨改建過(guò)程的穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)雌激素水平下降后，BMMSC中microRNA表達(dá)譜穩(wěn)態(tài)受到破壞，進(jìn)而引起下游靶基因表達(dá)異常，改變BMMSC的生物學(xué)行為，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。但是，這些假設(shè)還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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