嚴(yán) 紅，張 妍，高丹丹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

腎消顆粒由黃芪、丹參、淫羊藿、五味子等8味中藥組成，用于脾腎兩虛型糖尿病腎病及各種腎臟病變引起的蛋白尿，浮腫，腰膝酸痛，尿頻或混濁，陽痿遺精，臨床效果滿意。為有效控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，完善并提高原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文改進(jìn)了腎消顆粒中黃芪、淫羊藿的TLC鑒別方法，采用高效液相色譜法測定了淫羊藿中淫羊藿苷和丹參中丹參素鈉、原兒茶醛的含量。結(jié)果方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于腎消顆粒的質(zhì)量控制。制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高，對于保證藥物的臨床療效必將產(chǎn)生重要意義。

1 儀器與試藥

貝克曼高效液相色譜儀:125高壓輸液泵，168二極管陣列檢測器，Gold Chromatograhy Data System數(shù)據(jù)工作站。甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑為分析純;水為純化水。丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110855－200508)，原兒茶醛對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110810－200506)，淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號 110737－200413)，黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號11078－1200613)(“2.1”項(xiàng)下使用的對照品)。腎消顆粒(本院制劑室提供，批號 080505、080704、080924)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪和淫羊藿的TLC鑒別 取本品2 g，研細(xì)，加水飽和正丁醇25 ml，超聲提取30 min，濾過，濾液用氨試液10 ml提取1次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。取缺淫羊藿的陰性對照和缺黃芪的陰性對照樣品同法制備陰性對照液。另取黃芪甲苷、淫羊藿苷對照品，分別加甲醇制成每1 ml含黃芪甲苷1 mg、淫羊藿苷0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對照液各4 μl、對照品溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)5～10℃放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪和淫羊藿的TLC鑒別圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Irregular－H C18柱(250 mm ×4.6 mm，10 μm);丹參素鈉、原兒茶醛流動(dòng)相:甲醇－1%醋酸溶液(2∶98);流速:1.0 ml/min，進(jìn)樣量:20 μl;檢測波長為280 nm;柱溫:29℃;理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算不低于5 000。淫羊藿苷流動(dòng)相:乙腈－水(30∶70);流速:1.0 ml/min，進(jìn)樣量:20 μl;檢測波長為270 nm;理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算不低于3 000。

2.2.2 溶液液備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取丹參素鈉、原兒茶醛對照品適量，精密稱定，加過膜50%甲醇制成每1 ml含丹參素鈉300 μg(相當(dāng)于丹參素270 μg)、原兒茶醛24 μg的混合對照品儲備液。精密吸取丹參素鈉、原兒茶醛混合儲備液5 ml于50 ml量瓶中，加過膜50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加過膜甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷116 μg的對照品儲備液。精密吸取淫羊藿苷儲備液2 ml于10 ml量瓶中，加過膜甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)過3號篩，取1 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲30 min，取出，放冷，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得丹參素鈉、原兒茶醛供試品溶液。取本品研細(xì)過3號篩，取1 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 m l，密塞，稱定重量，超聲45 min，取出，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液20 ml，水浴蒸干，殘?jiān)铀? ml微熱溶解，加于預(yù)先處理好的D101型大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)徑為1.5 cm，柱高10 cm)，吸附 0.5 h，以水、30%乙醇各 50 ml洗脫，棄去，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液60 ml，水浴蒸干，殘?jiān)?0%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移置10 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得淫羊藿苷供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方取除丹參的各味藥材，按制備工藝制成顆粒，按供試品溶液制法制備丹參陰性對照溶液。按處方取除淫羊藿的各味藥材，按制備工藝制成顆粒，按供試品溶液制法制備淫羊藿陰性對照溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液20 μl注入液相色譜儀，結(jié)果表明陰性對照溶液無干擾，見圖2和圖3。

2.2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取丹參素鈉－原兒茶醛的混合對照品儲備液 0.25、1、2、3 和 4 ml，置 10 ml量瓶中，加過膜50%甲醇稀釋至刻度;精密吸取上述5種濃度的對照品溶液注入液相色譜儀，按相應(yīng)色譜條件分析，測定峰面積，以對照品溶液濃度(mg/ml)為縱坐標(biāo)，峰面積值為橫坐標(biāo)，求得丹參素鈉回歸方程:Y=8.577 E －008 X(r=0.999 9)。表明在 0.15 ～2.40 μg范圍內(nèi)線性良好。原兒茶醛回歸方程:Y=1.288 E －008 X+1.4 E －004(r=0.999 9)。結(jié)果表明在0.012 ～0.192 μg范圍內(nèi)線性良好。

精密吸取淫羊藿苷對照品儲備液 0.5、1、2、3、4 和5 ml，置10 ml量瓶中，加過膜甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述6種濃度的對照品溶液注入液相色譜儀，按相應(yīng)色譜條件分析，測定峰面積，以對照品溶液濃度(mg/ml)為縱坐標(biāo)，峰面積值為橫坐標(biāo)，淫羊藿苷回歸方程:Y=6.307 E －008 X(r=0.999 9)。表明在0.058 ～0.580 μg 范圍內(nèi)線性良好。

圖2 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

圖3 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中丹參素鈉峰面積RSD為0.86%;原兒茶醛峰面積RSD為1.43%;淫羊藿苷峰面積RSD為1.66%。

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品研細(xì)過3號篩，按“2.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，測得樣品中丹參素鈉平均含量為1.23 mg/g，RSD 為 1.95%;原兒茶醛平均含量為 0.108 mg/g，RSD 為 2.72%;淫羊藿苷平均含量為 0.358 mg/g，RSD 為 2.08%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8和24 h測定，測得丹參素鈉和原兒茶醛峰面積值的RSD為1.04%和1.70%，測得淫羊藿苷峰面積值的RSD為1.72%，表明腎消顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(丹參素鈉含量為 1.23 mg/g、原兒茶醛含量為 0.108 mg/g)約0.5 g，6份，精密稱定，分別精密加入丹參素鈉－原兒茶醛混合對照品儲備液2 ml，按供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣分析;取已知含量的樣品(淫羊藿苷含量為0.358 mg/g)約 0.5 g，6 份，精密稱定，分別精密加入淫羊藿苷對照品儲備液1.5 ml，按供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、淫羊藿苷回收率分別為100.3%、99.0%和96.1%，RSD 分別為 2.23%、2.23%和 1.89%。結(jié)果見表 1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 樣品測定 取3批樣品，按供試品溶液制備操作，按上述色譜條件分別測定樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、淫羊藿苷含量。結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

本試驗(yàn)以正丁醇直接提取樣品制備TLC鑒別用供試品溶液，簡化了原標(biāo)準(zhǔn)中甲醇提取，甲醇液蒸干水轉(zhuǎn)溶，正丁醇萃取的操作，TLC斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好。本實(shí)驗(yàn)在一個(gè)展開系統(tǒng)同時(shí)鑒別黃芪和淫羊藿，方法簡便，專屬性強(qiáng)。

曾對丹參流動(dòng)相及柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果甲醇－1%醋酸(2∶98)且柱溫為29℃時(shí)重現(xiàn)性和分離度較好，能同時(shí)測定丹參素鈉和原兒茶醛。

分別以甲醇、50% 甲醇、稀乙醇、70% 乙醇［1－3］超聲提取樣品，測定淫羊藿苷含量，結(jié)果，70%乙醇提取液淫羊藿苷含量最高。但提取液的雜質(zhì)峰很高，淫羊藿苷色譜峰相對于雜質(zhì)峰主峰很小。試驗(yàn)中進(jìn)一步對提取液分別采用正丁醇萃取法、乙酸乙酯萃取法［4］、D101大孔吸附樹脂乙醇梯度洗脫法［5］凈化樣品，測定淫羊藿苷含量，結(jié)果，正丁醇萃取法雜質(zhì)峰未見明顯改善，進(jìn)一步以氨試液洗除雜質(zhì)的同時(shí)淫羊藿苷損失大;乙酸乙酯萃取法和D101大孔吸附樹脂吸附法雜質(zhì)峰明顯降低，淫羊藿苷出峰明顯可見，分離好，二者所得淫羊藿苷含量無明顯差別?？紤]方法的簡便、可操作性及試劑的環(huán)保，選擇柱層析法，方法學(xué)驗(yàn)證表明準(zhǔn)確可靠，可作為測定本品主藥淫羊藿中淫羊藿苷的含量測定方法。

1 安軍永，劉敏彥，王玉峰.高效液相色譜法測定仙靈骨葆顆粒中淫羊藿苷的含量.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，23(1):41

2 程朝輝，霍榮昌，李瑾翡.乳增寧片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.中成藥，2008，30(4):附11

3 中國藥典.一部.2010:839

4 王海濤，張會宗.補(bǔ)腎健骨顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(4):135

5 付艷麗，徐忠亮，李源君.淫羊藿總黃酮的大孔樹脂精制工藝研究.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2008，10(4):636