劉 印，黃國(guó)英，于海云

(山東齊都藥業(yè)有限公司，山東臨淄255400)

甘露醇注射液［1］為《中國(guó)藥典》2010年版(二部)所收載，5%規(guī)格可用于外科手術(shù)用沖洗液。本文根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF1059－1999)、《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》(JJF1135－2005)和《化學(xué)分析中部確定度的評(píng)估指南》(CNAS －Q.06:2006)的規(guī)定，并參考有關(guān)文獻(xiàn)［2，3］，對(duì)甘露醇沖洗液中HPLC法測(cè)定甘露醇含量的測(cè)量不確定度進(jìn)行了分析。找出影響不確定度的因素，以提高數(shù)據(jù)和測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為評(píng)價(jià)檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 儀器與試藥 Anglient 1200高效液相色譜儀，示差折光檢測(cè)器。BS110S型分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。對(duì)照品:甘露醇(山東齊都藥業(yè)自制，批號(hào):1107071，含量100.3%)，山梨醇為自制對(duì)照品 (純度＞98%)。甘露醇沖洗液(山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào):101004，規(guī)格:1 000 mL:50 g)。

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 用磺化交聯(lián)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物為填充劑;色譜柱:Sugar－Pak1色譜柱(6.5 mm×300 mm)，柱溫為 80℃;水為流動(dòng)相，流速 0.5 mL·min－1;示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為55℃。另取甘露醇與山梨醇各50 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，甘露醇與山梨醇色譜峰之間的分離度應(yīng)大于2.0。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘露醇對(duì)照品適量，加水制成每1 mL含5 mg的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL(約相當(dāng)于甘露醇50 mg)，加水溶解定容于10 mL容量瓶中，即得。

1.3.3 測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2 不確定度分析與結(jié)果

化學(xué)分析中測(cè)量不確定度評(píng)估過程的步驟有:①被測(cè)量量的技術(shù)規(guī)定;②不確定度來源的確定和分析;③不確定度分量的量化;④計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度;⑤給出擴(kuò)展不確定度;⑥報(bào)告測(cè)量結(jié)果及不確定度。下面按這6個(gè)步驟進(jìn)行評(píng)定和表示本試驗(yàn)的測(cè)量不確定度。

2.1 被測(cè)量量的技術(shù)規(guī)定 主要說明被測(cè)量量，本法為外標(biāo)法測(cè)定甘露醇沖洗液中甘露醇的含量，假設(shè)直線經(jīng)過原點(diǎn)，建立其數(shù)學(xué)模型為:

Cs=(Mr×Vs×As)×F/(Vr×Ar×B)×100%

式中，Cs:為樣品中甘露醇濃度(合標(biāo)示量)%;As:樣品的峰面積響應(yīng)值;Mr:對(duì)照品的取樣量(g);Vs:樣品溶液的體積(mL);Ar:對(duì)照品的峰面積響應(yīng)值;Vr:對(duì)照品溶液的體積(mL);F:樣品非均勻性校正因子系數(shù)，值為1;B為標(biāo)示量(1 000 mL:50 g為定值，不需要考慮不確定度)。

2.2 不確定度來源的確定和分析

2.2.1 質(zhì)量(M) 由增量法稱量給出樣品和對(duì)照品的質(zhì)量，稱量不確定度主要來源于以下幾個(gè)方面:①稱量的重復(fù)性，屬于A類不確定度?？梢酝ㄟ^多次重復(fù)測(cè)量讀數(shù)、計(jì)算得出;②天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度，屬于B類不確定度;③天平稱量最大允差引入的不確定度，屬于B類不確定度。

2.2.2 體積(V) 移液管與容量瓶中的溶液體積主要不確定度來源有:①重復(fù)性，溶液充滿移液管及容量瓶至刻度的變化值，屬于A類不確定度，可通過多次測(cè)量得出;②容量瓶的允差，確定容量瓶?jī)?nèi)部體積時(shí)的不確定度，屬于B類不確定度;③溫度系數(shù)引起的不確定度，屬于B類不確定度，由于本文中測(cè)定溫度為20℃，與校準(zhǔn)時(shí)溫度一致，故此項(xiàng)可忽略。

2.2.3 峰面積響應(yīng)值(A) 高效液相峰面積響應(yīng)值主要由峰面積的重復(fù)性與儀器環(huán)境、進(jìn)樣體積等因素的不確定度共同引起。峰面積重復(fù)性引起的不確定度屬于A類不確定度，可通過多次測(cè)定得出;儀器環(huán)境、進(jìn)樣體積等因素引起的不確定度屬于B類不確定度，由于對(duì)照品與樣品峰面積是在相同條件下測(cè)得，所以此項(xiàng)可忽略。

2.2.4 樣品均勻性 即樣品測(cè)量的重復(fù)性，樣品的取樣會(huì)影響其含量測(cè)定結(jié)果，其產(chǎn)生的不確定度可以通過重復(fù)多份樣品的含量測(cè)量來求得，屬于A類不確定度。

2.2.5 對(duì)照品純度 甘露醇對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，由于尚無法得到不確定度參考值，故此項(xiàng)忽略。不確定度分量因果見圖1。

圖1 不確定度分量因果圖

2.3 不確定度分量的量化

2.3.1 As 樣品峰面積重復(fù)性，通過測(cè)定5份樣品的峰面積為1 726 477.8、1 733 043.1、1 724 403.8、1 728 184.1、1 729 142.3，計(jì)算 S值為3 229.111 2，測(cè)定次數(shù)為2 次，則 u

2.3.2 Ar 對(duì)照品峰面積重復(fù)性，通過測(cè)定對(duì)照品峰面積5次的峰面積為 1 726 598.8、1 727 114.5、1 727 614.2、1 727 838.2，計(jì)算 S 值為1 070.890 1，則 u(Ar)=1 070.890

2.3.3 Mr 對(duì)照品稱量不確定度主要有兩個(gè)來源:第一，重復(fù)性，也稱稱量變動(dòng)性，根據(jù)檢定證書，變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1 mg;第二，天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度，按檢定證書給出的不確定度U95=0.01 mg，按正態(tài)分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01/1.96=0.005 1 mg，由于樣品稱量采取增重法，所以:

2.3.4 Vr10 mL容量瓶的不確定度來源主要有兩種:第一，容量瓶體積的不確定度，按檢定證書給出的不確定度U95=0.02 mL，按三角分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.008 2 mL;第二，溫度與校準(zhǔn)溫度的差異，由于本試驗(yàn)溫度為20℃，與校準(zhǔn)溫度相同，所以此項(xiàng)可忽略。所以:u(Vr)=0.008 2 mL。

2.3.5 Vs10 mL容量瓶的不確定度來源主要有兩種:第一，容量瓶體積的不確定度，按檢定證書給出的不確定度U95=0.02 mL，按三角分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.008 2 mL;第二，溫度與校準(zhǔn)溫度的差異，由于本試驗(yàn)溫度為20℃，與校準(zhǔn)溫度相同，所以此項(xiàng)可忽略。u(Vs1)=0.008 2 mL。1 mL移液管的不確定來源主要有兩種:第一，容量瓶體積的不確定度，按檢定證書給出的不確定度U95=0.007 mL，按矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004 0 mL;第二，溫度與校準(zhǔn)溫度的差異，由于本試驗(yàn)溫度為20℃，與校準(zhǔn)溫度相同，所以此項(xiàng)可忽略。u(Vs2)=0.004 0 mL。所以:u(Vs)=mL。

2.3.6 F 取本品平行制備9份樣品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算 S 值為0.434 8，相對(duì)不確定度 u'=0.434 8/100.651 4=0.004 3，F(xiàn) 相關(guān)不確定度為 u(F)=u'(F)=0.004 3。

2.4 計(jì)算合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 含量測(cè)定的數(shù)值及其不確定度見表1。

表1 含量測(cè)定的數(shù)值及其不確定度

根據(jù)含量計(jì)算公式計(jì)算甘露醇沖洗液中甘露醇的含量為:Cs=(50.34×10×1 728 250.2)×1/(10×1 726 862.9×50)×100%=100.76%。

對(duì)于此乘法表達(dá)式，與每個(gè)分量相關(guān)的不確定度合成如下:u'(Cs)=［u'(As)2+u'(Mr)2+u'(Vs)2+u'(Ar)2+u'(Vr)2+u'(F)2］1/2=0.005 09;u(Cs)=100.76% × 0.005 09=0.512 9%。

不確定度的分量大小見圖2。

圖2 不確定度的分量大小

2.5 給出擴(kuò)展不確定度 取置信概率為95%包含因子k=2，將相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子得到相對(duì)擴(kuò)展不確定度。U(P)=2 ×0.512 9%=1.02%。

2.6 報(bào)告測(cè)量結(jié)果及不確定度 甘露醇沖洗液中甘露醇的含量為:Cs=(100.76±1.02)%，其中“±”后的數(shù)是擴(kuò)展不確定度U=ku(P)，由 u(P)=0.512 9%和k=2確定。k=2是根據(jù)置信概率為95%由t分布確定的。

3 討論

3.1 環(huán)境溫度和濕度的隨機(jī)變化會(huì)給質(zhì)量和體積帶來的影響，對(duì)質(zhì)量的影響將其不確定性歸入稱量重復(fù)性中;而對(duì)于體積，由于對(duì)照品溶液和供試品在相同條件下，由此引入的不確定性可忽略不計(jì)。溶液樣品的不均勻性，在計(jì)算公式中加入了均勻性因子，其作用是將樣品不均勻性產(chǎn)生的不確定度帶入公式，而與計(jì)算結(jié)果無關(guān)，所以設(shè)其值為1。對(duì)照品甘露醇購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，由于尚無法得到不確定度參考值，故此項(xiàng)忽略。

3.2 為分析不確定度的每個(gè)來源對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)，對(duì)6個(gè)因素進(jìn)行處理，見圖2。通過對(duì)圖2的分析表明:對(duì)照品的稱重引入的不確定度較大，為不確定度的主要來源。

3.3 本文提供了一種檢測(cè)結(jié)果測(cè)量不確定度計(jì)算的方法和思路，可以推廣用于同類方法測(cè)定成分的含量，分析引入的不確定度分量，找出影響較大的因素并在以后的實(shí)驗(yàn)過程中加以注意和改進(jìn)，以同步提高檢驗(yàn)水平和分析質(zhì)量。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:88.

［2］黃諾嘉，楊文紅，黃奕濱.HPLC法測(cè)定蘆薈膠囊中蘆薈苷含量的不確定度評(píng)定［J］.中國(guó)藥師，2009，12(9):1318－1320.

［3］岑志芳，高衛(wèi)東.HPLC法測(cè)定健胃消食片中橙皮苷含量的測(cè)量不確定度分析［J］.中國(guó)藥房，2010，21(19):1786－1788.