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      醇 水交換法提取樺褐孔菌生物活性物質(zhì)的工藝研究

      2012-10-25 02:07:48馬微微陳文華王新紅萬(wàn)雪蓮王德才
      食品工業(yè)科技 2012年21期
      關(guān)鍵詞:孔菌三萜類液料

      馬微微,陳文華,王新紅,萬(wàn)雪蓮,王德才

      (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086)

      醇 水交換法提取樺褐孔菌生物活性物質(zhì)的工藝研究

      馬微微,陳文華,王新紅,萬(wàn)雪蓮,王德才*

      (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086)

      目的:利用超聲熱學(xué)及空化技術(shù),研究醇-水交換提取樺褐孔菌中的三萜類和多糖生物活性物質(zhì)的最佳提取工藝。方法:樺褐孔菌粉碎,過(guò)30目篩,超聲輔助醇-水交換提取其生物活性物質(zhì)。結(jié)果:醇提三萜類物質(zhì)最佳工藝為:溫度30℃,時(shí)間50min,提取3次,液料比25∶1,得率為1.30%;水提多糖最佳工藝為:溫度50℃,時(shí)間40min,提取3次,液料比35∶1,得率為6.96%。結(jié)論:超聲輔助醇-水交換提取樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)的最佳提取工藝穩(wěn)定、合理可行,能有效提高樺褐孔菌的綜合利用。

      樺褐孔菌,醇-水交換,超聲

      樺褐孔菌是一種生長(zhǎng)在寒帶的木腐菌,主要寄生于白樺樹、銀樺、赤楊等的樹干或樹皮下。在我國(guó)主要生長(zhǎng)在吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區(qū)的樺屬樹木上[1]。隨著對(duì)樺褐孔菌化學(xué)成分研究的不斷深入,大量的活性物質(zhì)被分離出來(lái),目前已報(bào)道的除在水提取物中提取出的多糖外還含有醇提取物三萜類、樺褐孔菌醇和栓菌酸等200多種化學(xué)成分。作為樺褐孔菌的主要活性成分,三萜類物質(zhì)和多糖可用于抗腫瘤、抗艾滋病毒、治療糖尿?。?]、抗衰老[3]、降血壓、調(diào)節(jié)血脂[4]等。目前對(duì)樺褐孔菌三萜類物質(zhì)和多糖的綜合提取工藝尚很少報(bào)道,本文利用超聲熱學(xué)空化技術(shù),研究醇、水交換提取樺褐孔菌中的兩種生物活性物質(zhì)三萜類及多糖物質(zhì)的最佳提取工藝,充分利用樺褐孔菌資源,為促進(jìn)樺褐孔菌的開發(fā)和綜合利用提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      樺褐孔菌粉 產(chǎn)自伊春市五營(yíng)區(qū),40℃條件下烘干、粉碎、過(guò)30目篩;無(wú)水乙醇 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,分析純。

      KQ-100DB超聲波譜儀 昆山市超聲儀器有限公司;FW80粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司; RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TD4A離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;HPD-25A真空負(fù)壓過(guò)濾器 上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司; DZF-6030B真空干燥箱、HWS24電熱恒溫水浴鍋

      上海一恒科技有限公司;30目土樣分析篩 南京土壤儀器廠;UV-VIS8500紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 提取工藝流程

      1.2.2 操作要點(diǎn) 樺褐孔菌清選去雜,40℃條件下烘干、粉碎、過(guò)30目篩,取10.0g樺褐孔菌粉樣品,置于乙醇真空回流提取濃縮罐中,以液料比25∶1,30℃提取三次(50min/次),收集醇提液,過(guò)濾,真空減壓濃縮,乙醇回收,濃縮液真空干燥,得三萜類物質(zhì);殘?jiān)匆毫媳?5∶1的比例加入蒸餾水,50℃提取三次(40min/次),合并提取液,過(guò)濾,真空減壓濃縮,濃縮液醇沉12h,離心收集沉淀真空干燥,得多糖。

      1.2.3 樺褐孔菌三萜類物質(zhì)、多糖含量的測(cè)定 三萜類物質(zhì):香草醛比色法[5-6];多糖:苯酚—硫酸法[7]。

      1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 本研究采用醇-水交換法提取樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)。按1.2.1的提取工藝,以得率為指標(biāo),主要考察提取方法、溫度、時(shí)間、提取次數(shù)和液料比對(duì)三萜類物質(zhì)和多糖得率的影響。

      1.2.5.1 提取方法對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:溫度為40℃,液料比20∶1,溶劑為無(wú)水乙醇,超聲波功率為100W,采用溶液浸提法與超聲輔助提取法,分別提取20、40、60min,提取三次。

      多糖的提取:溫度為50℃,液料比20∶1,溶劑為蒸餾水,超聲波功率為100W,采用溶液浸提法與超聲輔助提取法,分別提取30、40、50min,提取三次。

      1.2.5.2 提取溫度對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取時(shí)間為40min,液料比20∶1,超聲波功率為100W,分別在溫度為20、30、40、50℃中提取,測(cè)得率。

      多糖的提取:固定提取時(shí)間為40min,液料比20∶1,超聲波功率為100W,分別在溫度為40、50、60、70、80℃中提取,測(cè)得率。

      1.2.5.3 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取溫度為40℃,液料比20∶1,超聲波功率為100W,分別在時(shí)間為20、30、50、60min時(shí)提取,測(cè)得率。

      多糖的提取:固定提取溫度為 50℃,液料比20∶1,超聲波功率為100W,分別在時(shí)間為30、40、50、60min時(shí)提取,測(cè)得率。

      1.2.5.4 提取次數(shù)對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取溫度為40℃,液料比20∶1,超聲波功率為100W,提取時(shí)間為40min,分別提取四次,測(cè)得率。

      多糖的提取:固定提取溫度為 50℃,液料比40∶1,超聲波功率為100W,提取時(shí)間為40min,分別提取四次,測(cè)得率。

      1.2.5.5 液料比對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取溫度為40℃,提取時(shí)間為40min,超聲波功率為100W,液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1,測(cè)得率。

      多糖的提取:固定提取溫度為50℃,提取時(shí)間為50min,超聲波功率為100W,液料比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1,測(cè)得率。

      1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比四種單因素考察的基礎(chǔ)上,選用正交表L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1、表2。

      表1 醇提因素與水平L9(34)Table 1 Factors and levels on alcohol extraction conditions

      表2 水提因素與水平L9(34)Table 2 Factors and levels on water extraction conditions

      1.2.7 醇析濃度對(duì)多糖得率的影響 取等體積的水提液5份,每份100mL,分別加入100、200、300、400、500mL的無(wú)水乙醇,靜置12h后,離心收集沉淀,烘干稱重,并記錄。

      1.2.8 醇沉溫度對(duì)多糖得率的影響 乙醇沉淀法提取多糖時(shí),醇沉的溫度是影響多糖得率的重要因素,本實(shí)驗(yàn)采用不同溫度(4、25℃)來(lái)沉淀多糖,測(cè)多糖得率。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 三萜類物質(zhì)含量測(cè)定

      以吸收度(y)對(duì)齊墩果酸含量(x)進(jìn)行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0027x,r2=0.998。

      2.2 多糖含量測(cè)定

      以吸收度(y)對(duì)葡萄糖含量(x)進(jìn)行回歸,得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.3596x-0.0143,r2=0.995。

      2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

      2.3.1 提取方法對(duì)得率的影響 超聲波提取技術(shù)[8]是利用超聲波特殊的強(qiáng)縱向振動(dòng),高速?zèng)_擊破碎,產(chǎn)生空化效應(yīng),以達(dá)到攪拌及加熱等物理性能。破壞提取物細(xì)胞結(jié)構(gòu),使溶媒能滲入細(xì)胞內(nèi)部,從而加速有效成分的溶解,提高有效成分的提出率,實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析證明超聲波提取可大大縮短提取時(shí)間,提高提取率,并且不改變有效成分的結(jié)構(gòu)[9]。由圖1可見,在提取三萜類物質(zhì)和多糖中,在同一時(shí)間點(diǎn)采用超聲波輔助法的提取率均高于傳統(tǒng)水浴法,具有省時(shí)、高效、節(jié)能、易操作等優(yōu)點(diǎn);溫度高時(shí)會(huì)有部分提取物分解,而超聲波提取能在低溫條件下保證提取物的得率。因此,超聲輔助法優(yōu)于傳統(tǒng)水浴提取。

      圖1 提取方法對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of methods on extraction yield

      2.3.2 溫度對(duì)得率的影響 由圖2可見,超聲波輔助方法提取溫度低時(shí)溶出物少,有效成分含量低;隨著溫度增加,細(xì)胞膜破碎程度增強(qiáng),溶出物增多,同時(shí)溫度增加可以加快溶劑的運(yùn)動(dòng)速度,減少溶質(zhì)在固體表面的吸附作用,使細(xì)胞中活性物質(zhì)迅速進(jìn)入到溶劑中,得率也就增高。但值得注意的是:溫度過(guò)高對(duì)溶解物破壞的可能性大。三萜類物質(zhì)在40℃時(shí)得率最高,達(dá)到1.30%;多糖在50℃時(shí)得率最高,達(dá)到6.87%。

      圖2 溫度對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction yield

      2.3.3 時(shí)間對(duì)得率的影響 提取時(shí)間決定著生產(chǎn)的周期,是生產(chǎn)工藝研究中的一個(gè)十分重要的影響因素,它決定著生產(chǎn)成本和能源的消耗。由圖3可見,在一定時(shí)間范圍內(nèi),得率隨時(shí)間的增加而增加。這是由于超聲時(shí)間較短時(shí),溶出物較少,提取物含量較低;隨著時(shí)間增加,細(xì)胞膜破碎程度增強(qiáng),溶出物增多,得率隨之增高。三萜類物質(zhì)、多糖分別在50、40min時(shí)得率最高,分別為1.3%、6.87%。當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有效成分已經(jīng)完全溶出,細(xì)胞壁進(jìn)一步破碎,溶解雜質(zhì)相應(yīng)增加,得率反而降低,違背了縮短工時(shí),減少能耗的原則。

      2.3.4 提取次數(shù)對(duì)得率的影響 由圖4可知:得率是隨著提取次數(shù)的增加而增加的。在提取三萜類物質(zhì)和多糖實(shí)驗(yàn)中,提取三次均比提取兩次更為明顯的增加,而提取四次較三次而言略微改變??紤]到費(fèi)時(shí)因素,避免浪費(fèi)能源,增加濃縮工序的難度,選擇提取三次作為最佳提取次數(shù)。

      圖3 時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield

      圖4 次數(shù)對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of times on extraction yield

      2.3.5 液料比對(duì)得率的影響 由圖5可見,當(dāng)乙醇提取三萜類物質(zhì),液料比在10∶1~20∶1時(shí),三萜類物質(zhì)得率隨著液料比的增加而增加,隨后得率隨之下降,

      在液料比為20∶1時(shí)得率最高,為1.32%??芍?,溶劑量過(guò)小,提取物質(zhì)不能完全溶出;溶劑量過(guò)大時(shí),超聲波輻射又被溶劑大量吸收,從而影響得率。當(dāng)水提取多糖,液料比在20∶1~30∶1時(shí),多糖得率隨著液料比的增加而增加,在液料比30∶1~35∶1時(shí)得率之間無(wú)顯著差異,隨后得率隨之下降。由于浸提液的后續(xù)工序中需濃縮,若水量增加,工序也隨之增加,因此水提多糖液料比選為30∶1。

      圖5 液料比對(duì)得率的影響Fig.5 Effect of ratio of solvent to material on extraction yield

      2.3.6 醇析濃度對(duì)多糖得率的影響 乙醇沉淀法提取多糖時(shí),乙醇的濃度對(duì)多糖得率影響很大。一般情況下,多糖的分子量越大,被沉淀下來(lái)所需的乙醇濃度就越小。由圖6可見,當(dāng)乙醇用量為水提取液3倍時(shí),得率最高,當(dāng)乙醇用量大于水提取液3倍時(shí),多糖得率隨之下降,這是由于隨乙醇濃度升高,一些多糖中醇溶蛋白分子溶于乙醇中,有些多糖分子與醇溶蛋白相結(jié)合,使多糖也溶于乙醇溶液中,不被沉淀下來(lái),造成多糖得率的降低。

      圖6 醇析濃度對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polysaccharides

      2.3.7 醇沉溫度對(duì)多糖得率的影響 醇沉法就是利用有效成分能溶于乙醇而雜質(zhì)不溶于乙醇的特性,在加入乙醇后,有效成分轉(zhuǎn)溶于乙醇中而雜質(zhì)則被沉淀出來(lái)[10]。醇沉溫度低,沉淀物析出與沉降的速度加快,所需的靜置時(shí)間短,反之則長(zhǎng)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,在4、25℃條件下,多糖得率分別為6.86%和6.25%。由此可見,4℃醇沉效果明顯好于25℃,這是由多糖在不同的溫度下溶解度不同造成的。

      2.2 正交實(shí)驗(yàn)

      根據(jù)表3三萜類物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析得知,影響因素顯著性順序?yàn)?D>C>B>A,得率最高組合為A1B3C3D3,即以溫度30℃,時(shí)間50min,提取3次,液料比25∶1。為了對(duì)三萜類物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證,采用此組合,做了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所測(cè)得三萜類物質(zhì)分別為1.28%,1.30%,1.32%,平均值為1.30%,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的數(shù)值與優(yōu)化的結(jié)果相吻合,說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是可行的。

      表3 樺褐孔菌三萜類物質(zhì)提取條件的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test on triterpenoids extraction conditions

      根據(jù)表4多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析得知,影響因素顯著性順序?yàn)?D>C>B>A,正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合為 A2B2C3D3,即以提取溫度50℃,提取時(shí)間40min,提取3次,液料比35∶1。但表4中沒(méi)有此項(xiàng)組合,故按此組合重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn),測(cè)得多糖分別為6.99%、6.95%、6.93%,平均值為6.96%,高于表4出現(xiàn)最高值,故采用此組合為最優(yōu)組合。

      表4 樺褐孔菌多糖提取條件的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

      3 結(jié)論

      本研究利用超聲熱學(xué)及空化技術(shù),研究醇-水交換提取森林藥食兩用多孔真菌—樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)的最佳提取工藝及技術(shù)。采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。得出三萜類物質(zhì)最佳提取工藝為:溫度30℃,時(shí)間50min,提取3次,液料比25∶1,得率為1.30%;多糖最佳提取工藝為:溫度50℃,時(shí)間40min,提取3次,液料比35∶1,得率為6.96%。

      [1]YOO K P,HYANG B L,EUN-J J,et al.Chaga mushroom extract inhibits oxidative DNA damage in human lymphocytes as assessed by comet assay[J].Bio Factors,2004,21:109-112.

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      [3]RASINA LN.Effect of cryosubstance Chagi on deposition or isolation of 90Sr and on the effect of Prolonged external exposure to gamma-radiation[J].Radiats Biol Radioecol,2002,42(4):399-403.

      [4]張惠麗,楊松,李玉,等.樺褐孔菌多糖的提取及對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的抗增殖的研究[J].中國(guó)食用菌,2006,25(2): 31-33.

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      Study on the method for ethanol-water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquus

      MA Wei-wei,CHEN Wen-h(huán)ua,WANG Xin-h(huán)ong,WAN Xue-lian,WANG De-cai*(College of Public Health,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)

      Objective:To studya method forethanol-waterexchanging extraction oftriterpenoidsand polysaccharides fromInonotus obliquusby ultrasound thermal and cavitation technology.Methods:ShatteredInonotus obliquus,filtered them by 30 mesh filter sieve,extracted biological activity content by ethanol-water exchanging and ultrasonic technology.Results:The ethanol optimum extraction of triterpenoids was as follow: extraction temperature 30℃,time 50min,extraction times 3,the rate of liquid and solid 25∶1,and the best extraction was 1.30%.The water optimum extraction of polysaccharides was as follow:extraction temperature 50℃,time 40min,extraction times 3,the rate of liquid and solid 35∶1,and the best extraction was 6.96%.Conclusion:The optimum extraction which ethanol-water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquusby ultrasonic technology was steady,reasonable and improve comprehensive utilization ofInonotus obliquuseffectively.

      Inonotus obliquus;ethanol-water exchanging;ultrasound

      TS201.2

      B

      1002-0306(2012)21-0273-04

      2012-04-13 *通訊聯(lián)系人

      馬微微(1985-),女,碩士研究生,研究方向:植物化學(xué)生物活性物質(zhì)的提取、鑒定、保健功能。

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