臧佳辰，薛文通

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與科學(xué)工程學(xué)院，北京 100083)

酶法純化ω-6和ω-3多不飽和脂肪酸研究進(jìn)展

臧佳辰，薛文通*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與科學(xué)工程學(xué)院，北京 100083)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)具有重要的生理學(xué)活性，尤其是ω－6和ω－3系列與人體健康密切相關(guān)。因此，如何提取PUFAs非常重要，也是油脂領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。利用酶法分離純化PUFAs是一種環(huán)保、高效、具有廣泛應(yīng)用前景的方法。本文綜述了酶法純化ω－6和ω－3PUFAs的最新研究進(jìn)展，并著重闡述了酶法催化水解、酶法選擇性富集以及其它幾種能和酶法有效結(jié)合、共同分離純化PUFAs的物理化學(xué)方法，同時(shí)通過論述亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等PUFAs的純化進(jìn)展證明了酶法在該領(lǐng)域內(nèi)具有很大發(fā)展前景。

ω－6多不飽和脂肪酸，ω－3多不飽和脂肪酸，酶法催化水解，酶法選擇性富集

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上雙鍵結(jié)構(gòu)的脂肪酸，根據(jù)第一個(gè)不飽和鍵位置不同，PUFAs可分為ω－3、ω－6、ω－7、ω－9等系列［1］。這是一種具有獨(dú)特生理活性的物質(zhì)，對(duì)人體的生理功能至關(guān)重要，尤其是ω－3和ω－6系列，它們?cè)隗w內(nèi)的平衡對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞膜功能、調(diào)控基因表達(dá)、維持細(xì)胞因子和脂蛋白平衡、減肥、抗心血管病、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、抗炎、抗癌等方面發(fā)揮著重要作用，因此，其生理學(xué)活性已成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。ω－6系列的花生四烯酸(AA)、亞油酸(LA)、γ－亞麻酸(GLA)，ω－3系列的α－亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等由于在體內(nèi)不能合成轉(zhuǎn)化發(fā)揮其獨(dú)特的生理功能而被添加于嬰兒奶粉、營(yíng)養(yǎng)品以及藥物成分之中［2］。隨著PUFAs在食品、醫(yī)藥、化工、飼料等多個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如何將其分離純化變得非常重要。目前，用于從油脂中分離純化PUFAs的方法主要包括:色譜法、蒸餾法、溶劑提取法、低溫結(jié)晶法、超臨界萃取法以及尿素包合法等［3］。本文所要重點(diǎn)闡述的酶法是一種新型、高效、綠色的方法，此方法突出的特點(diǎn)在于:反應(yīng)可以在溫和的條件下進(jìn)行，從而能夠減少由于異構(gòu)化、氧化、聚合等副反應(yīng)的發(fā)生而造成的PUFAs失活，而且可以避免使用一些有機(jī)溶劑，這樣不僅更環(huán)保，也降低了相應(yīng)的食品安全問題的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還有效地提高了提取的收率［4］。近年來，隨著生物技術(shù)水平的提高，相應(yīng)的酶制劑也實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的生產(chǎn)，尤其是固定化酶的廣泛推廣，使酶可以反復(fù)利用從而降低了成本，也打消了人們之前對(duì)于酶法成本過高的憂慮。所以，出于多種原因考慮，將酶法運(yùn)用于PUFAs的分離純化，已成為了該領(lǐng)域的新方向。

1 酶法純化PUFAs方法概述

脂肪酶對(duì)油脂的作用可以分為選擇性作用和非選擇性作用。

1.1 非選擇性作用

脂肪酶的非選擇性反應(yīng)主要用于水解油脂制取游離脂肪酸，與傳統(tǒng)的堿試劑皂化法相比，酶法具有耗能少、產(chǎn)物色澤好、質(zhì)量高、水解率高等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)于一些含有不飽和鍵較多、易氧化和產(chǎn)生副反應(yīng)的油脂水解更為適宜［4］。60年代初，山田等研制的圓柱形假絲酵母脂肪酶制劑是世界上微生物脂肪酶中生產(chǎn)量最大、應(yīng)用工作最多、水解油脂快而且徹底的品種之一［5］。這種酶也成功的運(yùn)用于豆油、花生油、橄欖油等。國(guó)外也早有先例將酶法分解油脂運(yùn)用于大規(guī)模的生產(chǎn)之中，如日本尼崎油脂公司于八十年代就完成了酶法生產(chǎn)脂肪酸中試，并大量投產(chǎn)脂肪酸。三號(hào)油脂公司也將酶法批量生產(chǎn)脂肪酸用于制造肥皂粉，使生產(chǎn)成本下降一半以上，而我國(guó)在這方面還有待提高。

1.2 選擇性作用

特異性的脂肪酶可以通過選擇性作用，將PUFAs富集在甘油酯上，這種富集了PUFAs的甘油酯在消化道中的水解速率比利用物理或化學(xué)方法富集得到相應(yīng)的甲酯或乙酯快而更容易被人們接受和信賴［6］。依據(jù)作用原理的不同，又可以分為選擇性水解法、選擇性酯化法和選擇性酯交換法。

1.2.1 選擇性水解 脂肪酶種類繁多，功能各有差異，可能具有位置選擇性或者?；x擇性。圖1以AA和LA為例展示了PUFAs因結(jié)構(gòu)的高度卷曲使甘油酯分子上不飽和脂肪酸中靠近酯鍵的最末端甲基對(duì)脂肪酶的進(jìn)攻形成了空間位阻，使得脂肪酶難以接觸到PUFAs與甘油形成的酯鍵。Bottino等人［7］最早證明了脂肪酶的選擇性與魚油中不飽和脂肪酸對(duì)脂肪酶的“抵抗機(jī)制”有關(guān)。之后，這種機(jī)制也多次被驗(yàn)證和應(yīng)用［8－11］。Sulainman Al－Zuhair等［12］還探究了酶法水解棕櫚油的動(dòng)力學(xué)，為進(jìn)一步優(yōu)化水解條件提供了依據(jù)。

圖1 AA和ALA高度彎曲的空間結(jié)構(gòu)Fig.1 The highly binding space structure of AA and ALA

1.2.2 選擇性酯化 脂肪酶的選擇性酯化建立在游離脂肪酸的基礎(chǔ)之上，依據(jù)其選擇特異性，脂肪酶催化游離脂肪酸中的多不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸按照一定順序與醇反應(yīng)生成酯，再經(jīng)過分離即可獲得純度較高的PUFAs甘油酯或游離PUFAs。Robles Medina等［13］通過脂肪酶Novozym435富集魚油以及微藻類中的油脂，使魚肝油中的酯化率達(dá)到93.5%，包括25.7%的EPA和44.7%的DPA。將同樣的方法應(yīng)用于微藻類油脂，酯化率達(dá)到了96.5%，而且其中不含單甘酯，雙甘酯量極少。Carla Tecelao等［14］還通過選擇性酯化的方法將PUFAs富集到人奶脂上，對(duì)嬰幼兒的營(yíng)養(yǎng)供給提出了新的啟示，可見酶法純化脂肪酸的相關(guān)技術(shù)也可以應(yīng)用在功能食品研發(fā)的廣泛領(lǐng)域上。

工業(yè)化選擇性酯化純化PUFAs工藝主要要求體系具有以下條件:具有高度脂肪酸轉(zhuǎn)移性;酶反應(yīng)體系具有高酯化度;分離過程對(duì)游離脂肪酸破壞性較低。其基本工藝流程如圖2［15］。

圖2 選擇性酯化PUFA工藝流程Fig.2 The flow of elective esterification of PUFAs

1.2.3 選擇性酯交換 脂肪酶選擇性酯交換法是通過脂肪酶使甘油酯與游離的PUFAs、醇或另一酯發(fā)生的?；粨Q反應(yīng)，從而使PUFAs較多的富集在甘油酯中。Shahidi等人［3］曾系統(tǒng)闡述了通過脂肪酶酯交換法富集ω－3PUFAs的方法［16］。

但在具體富集PUFAs的應(yīng)用中，僅用一種酶催化一步反應(yīng)難以將PUFAs富集到所需要的產(chǎn)量。而水解、酯化和酯交換反應(yīng)結(jié)合在一起使用，往往能達(dá)到更好的富集效果。Shimada等［16］通過Lipase－AK來水解金槍魚油，水解程度達(dá)到79%，大部分DHA富集在游離脂肪酸中，然后通過Rhizopus delemar脂肪酶對(duì)混合物與月桂醇進(jìn)行選擇性酯化，得到游離脂肪酸中DHA含量較高的游離脂肪酸、脂肪酸乙酯或者脂肪酸甘油酯，再將游離脂肪酸提取出來，同樣條件下進(jìn)行二次酯化，最終使DHA含量達(dá)到91%。

2 酶法純化ω-6 PUFAs的研究進(jìn)展

2.1 亞油酸(LA)及共軛亞油酸(CLA)

亞油酸是γ－亞麻酸、花生四烯酸、腎上腺酸、二十二碳五烯酸等對(duì)人體具有重要生理意義的多不飽和脂肪酸的合成原料，人體如果缺乏亞油酸就不能合成這些多不飽和脂肪酸。共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸的同分異構(gòu)體，是一系列在碳9、11或10、12位具有雙鍵的亞油酸的位置和幾何異構(gòu)體，是普遍存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［17］。由于物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)較為相似，傳統(tǒng)的分離方法很難將不同的共軛亞油酸，如c9，t11－CLA和t10，c12－CLA進(jìn)行分離。Gerald等［18］發(fā)現(xiàn)采用選擇性的脂肪酶對(duì)共軛亞油酸進(jìn)行酯化可以有效地解決這個(gè)問題。他們利用Geotrichum candidum脂肪酶對(duì)c9，t11－CLA的酯化速度遠(yuǎn)高于t10，c12－CLA這一特點(diǎn)，反應(yīng)得到含91%c9，t11－CLA的酯化產(chǎn)物和含82%t10，c12－CLA的游離脂肪酸產(chǎn)物，從而對(duì)兩種PUFAs進(jìn)行了分離純化。實(shí)驗(yàn)還采用了一種非選擇性的脂肪酶即固定化Rhizomucor miehei脂肪酶同時(shí)將兩種共軛亞油酸通過酯交換反應(yīng)富集到棕櫚油中，使棕櫚油中的共軛亞油酸含量達(dá)到30%，而殘留的游離共軛亞油酸含量?jī)H不到2%。

2.2 γ-亞麻酸(GLA)

琉璃苣油中含有豐富的ω－6 PUFAs，其中GLA這種只在母乳才能找到的必需脂肪酸高達(dá)25%～30%，也是天然植物油中含 GLA濃度最高的。Patricia等對(duì)比了包括天然脂肪酶和商業(yè)脂肪酶在內(nèi)的不同脂肪酶富集琉璃苣油中GLA的數(shù)據(jù)。其中天然Geotrichum candidum脂肪酶具有較高水解率，可以獲得88.2%的游離脂肪酸，雖然這種酶的酶活力比其他脂肪酶較低，但對(duì)GLA確有較好的富集能力，在適當(dāng)提高酶用量后，能將琉璃苣油中的GLA含量由22.1%提高到41.7%。同時(shí)他們利用電腦輔助程序?qū)Ψ磻?yīng)動(dòng)力參數(shù)進(jìn)行了分析優(yōu)化，為大規(guī)模批次生產(chǎn)和連續(xù)式富集GLA建立了反應(yīng)模型［19］。

2.3 花生四烯酸(AA)

花生四烯酸作為一種必需脂肪酸對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)尤其是腦部發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，所以常被添加到嬰幼兒奶粉中。傳統(tǒng)的花生四烯酸來源:動(dòng)物肝臟、魚油、蛋黃等食物中AA的含量非常少，難以滿足需求。所以近年來，人們?cè)絹碓蕉嗟牟捎梦⑸锱囵B(yǎng)的方式獲取富含花生四烯酸的油脂［20］。Shimada等［21］通過酶法富集Mortierella單細(xì)胞油脂中的花生四烯酸，首先通過Pseudomonas脂肪酶對(duì)油脂進(jìn)行水解，水解率達(dá)到90%，第二步在Candida脂肪酶的作用下，將游離的花生四烯酸選擇性酯化在月桂醇上，酯化率達(dá)到55%，為了進(jìn)一步提高AA含量，實(shí)驗(yàn)通過Candida脂肪酶的二次酯化，最終將AA含量從最初的25%提高到了75%。

3 酶法純化ω-3 PUFAs的研究進(jìn)展

中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)在2000年提出的人體內(nèi)最佳的ω－6:ω－3PUFAs比值為4∶1～6∶1。而傳統(tǒng)的飲食成分，尤其是西方飲食中，ω－6PUFAs的比例往往遠(yuǎn)高于ω－3PUFAs，這種失衡會(huì)嚴(yán)重影響人體的生理功能，導(dǎo)致心腦血管、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病［22］。ω－3PUFAs為人體必需脂肪酸，同時(shí)人體缺乏將ω－6PUFAs轉(zhuǎn)化為ω－3PUFAs的必需酶，所以如何富集純化 ω－3PUFAs以提高人體攝入量更加受到關(guān)注。

3.1 α-亞麻酸(ALA)

紫蘇子油、亞麻油等植物油中α－亞麻酸的含量達(dá)到50%以上。魏決等利用脂肪酶水解紫蘇子油，并使用尿素包合法提取了游離脂肪酸中的ɑ－亞麻酸，避免了傳統(tǒng)方法中由于酸、堿及溫度造成的ɑ－亞麻酸的變性，并通過對(duì)各項(xiàng)條件的優(yōu)化，使水解率提高到90.02%［23］。Vacek等［24］對(duì)比了不同脂肪酶對(duì)黑加侖油中的ALA和GLA進(jìn)行富集的效果，實(shí)驗(yàn)證明，Pseudomonas cepacia脂肪酶具有最高的水解率，另外，Pseudomonas cepacia固定化脂肪酶、Mucor miehei脂肪酶以及Pseudomonas fluorescens脂肪酶對(duì)兩種PUFAs具有特異性水解能力，為大規(guī)模酶法純化ALA提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)

EPA和DHA作為ω－3PUFAs系列中最重要的兩種脂肪酸，在預(yù)防癌癥、肥胖、神經(jīng)性疾病等多個(gè)方面發(fā)揮著重要的作用。EPA和DHA主要來源于海洋單細(xì)胞藻類和魚油中，從這些來源中提取這兩種多不飽和脂肪酸也有較長(zhǎng)的歷史［25－26］。研究證明，機(jī)體攝入富集EPA和DHA的濃縮產(chǎn)物會(huì)由于飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量減少而比食用原始的海藻油或者魚油更加有效。而采用酶法處理更溫和，從而得到高質(zhì)量的EPA、DHA富集產(chǎn)物。

Tomoko等［27］分別采用四種脂肪酶來富集沙丁魚油中的EPA和DHA，實(shí)驗(yàn)證明，Candida Rugosa脂肪酶在短時(shí)間內(nèi)將產(chǎn)物中的EPA含量從13.62%提高到了 33.74%，DHA含量從 13.62%提高到了29.94%，效果顯著。而其它脂肪酶不能明顯的富集ω－3PUFAs，或者反應(yīng)速度太低，所以在采用酶法純化PUFAs時(shí)，對(duì)脂肪酶的篩選主要考慮酶的專一性和反應(yīng)效率。Derya等［28］也通過脂肪酶Candida rugosa對(duì)鮭魚油中的EPA和DHA進(jìn)行了富集，使兩種ω－3PUFAs總含量從原來的16.36%提高到了38.71%，實(shí)驗(yàn)將游離脂肪酸去除之后，對(duì)甘油酯進(jìn)行了二次水解，所得產(chǎn)物中二者的總含量達(dá)到了50.58%。

4 與酶法有效結(jié)合的其它方法

PUFAs的分離純化在脂肪酶作用的基礎(chǔ)上，借助一些其他手段，分離效率可以得到進(jìn)一步提高。比如，LeGoffic等［29］將短途蒸餾法結(jié)合在對(duì)不同PUFAs的分離之中，有效地將魚油中的DHA和EPA分成各自含量較高的兩部分。但短途蒸餾可能會(huì)造成高溫，容易導(dǎo)致PUFAs的氧化，可以采用分子蒸餾法在較低的溫度下進(jìn)行。近年來，很多研究利用超臨界CO2綠色、無毒、易從產(chǎn)物中抽離的特點(diǎn)將其作為酶法分離制備的介質(zhì)，取得了良好的效果。如Lin等［30］通過脂肪酶Lipozyme IM－60對(duì)魚油中的PUFAs在超臨界CO2條件下進(jìn)行酶促酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)酯交換率比傳統(tǒng)溶劑法提高了40%。同時(shí)，通過高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜等對(duì)脂肪酸或甘油酯成分進(jìn)行分離鑒定，也是PUFAs的分離提取必不可少的步驟?？梢姡绻麑⒚阜ㄅc各種適宜的物理化學(xué)方法相結(jié)合，可以進(jìn)一步提高PUFAs的分離純化水平。

5 固定化酶技術(shù)在純化多不飽和脂肪酸方面的應(yīng)用

近年來，生物工程的發(fā)展以及酶技術(shù)的進(jìn)步為脂肪酶以及油脂行業(yè)帶來了新的氣息。歐洲在酯酶基因克隆和工程菌構(gòu)建方面研究較早，多種酵母、真菌和細(xì)菌等微生物的酯酶基因已經(jīng)相繼被克隆，來源于假絲酵母、根霉和假單胞菌的酯酶均已用于PUFAs的富集實(shí)驗(yàn)。Suen等［31］利用DNA混排技術(shù)將Candida antarctica脂肪酶活性提高了20倍。薛靜等［32］還探究了產(chǎn)酶菌株的篩選，對(duì)影響菌株產(chǎn)酶的因素進(jìn)行了研究，經(jīng)過條件優(yōu)化，使酶活力提高了1.83倍。在此基礎(chǔ)上，酶的固定化技術(shù)進(jìn)一步用于脂肪酶的活性保持，即通過將脂肪酶限定于空間某一區(qū)域內(nèi)，能夠提高酶的穩(wěn)定性并可回收重復(fù)利用，便于連續(xù)化生產(chǎn)。在酶法富集PUFAs方面，采用固定化酶處理也越來越多，如嚴(yán)金勇等采用固定化地絲菌脂肪酶來富集魚油中的DHA和EPA，發(fā)現(xiàn)該酶使用五次之后仍能保持最初80%的水解率［33］。固定化酶的發(fā)展使酶在PUFAs的純化中實(shí)現(xiàn)了既高效又低廉。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，酶法應(yīng)用于PUFAs的分離提取具有以下優(yōu)勢(shì):一、脂肪酶催化反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行，從而防止了PUFAs的失活、異構(gòu)化、氧化、環(huán)化等不良反應(yīng);二、通過酶替代有機(jī)溶劑，不僅使產(chǎn)品更加綠色、安全，避免了環(huán)境污染問題，也防止了可能引發(fā)爆炸等危險(xiǎn)的可能性;三、酶法既可以有效的和其它分離純化的物理化學(xué)方法相結(jié)合，也可以作為物理化學(xué)方法的前處理過程，用途廣泛，顯著提高提取率;四、生物技術(shù)和發(fā)酵工程的發(fā)展，也帶動(dòng)了酶產(chǎn)業(yè)的快速提高，菌種篩選、酶的修飾、固定化酶技術(shù)等都有效提高了酶的活性，并為實(shí)現(xiàn)酶法工業(yè)化提供了依據(jù)，這些都是酶法制備多不飽和脂肪酸的優(yōu)勢(shì)所在。在未來的發(fā)展中，開發(fā)催化效率更高、選擇性更強(qiáng)，以及穩(wěn)定性更持久的脂肪酶以更好的適應(yīng)工業(yè)化的需求是酶法制備ω－6和ω－3多不飽和脂肪酸的趨勢(shì)，總的來說，這一領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

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Research progress in purification of ω－6/ω－3 polyunsaturated fatty acids by enzyme

ZANG Jia－chen，XUE Wen－tong*
(College of Food Science＆Nutritional Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China)

The importance of polyunsaturated fatty acids(PUFAs)，especially ω－6/ω－3 series，is scientifically recognized in human nutrition and disease prevention.With the emphasis on nutrition on the rise，how to purify PUFAs has already been a hot topic in various areas.Some physical or chemical methods are popular nowadays.However，research is ongoing to obtain the more natural and efficient ways with biological methods like enzymatic purification.This artide presented a review of the advances regarding the purification of ω－6/ω－3 PUFAs with enzymatic ways including enzymatic hydrolysis，selective enrichment，and some other methods with high expectation which could be connected with enzymatic method efficiently.The process of purification of AA，LA，GLA，DHA，EPA had been emphasized.Enzymatic method was a promising way for the purification of PUFAs.And in that sense，this review was expected to be of interest.

ω－6PUFAs;ω－3PUFAs;enzymatic hydrolysis;selective enrichment

TS201.1

A

1002－0306(2012)21－0365－05

2012－05－14 *通訊聯(lián)系人

臧佳辰(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171672)。