米糠蛋白提取中的關(guān)鍵影響因素及其優(yōu)化

管 驍，金周筠，金 晶，黃成龍，金 龍

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

米糠蛋白提取中的關(guān)鍵影響因素及其優(yōu)化

管 驍，金周筠，金 晶，黃成龍，金 龍

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

研究米糠蛋白制備過程中存在的提取率低、產(chǎn)品顏色深等問題。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析方法對(duì)提取溫度、pH值、液料比以及輔助劑用量4因素進(jìn)行優(yōu)化，建立響應(yīng)值(包括蛋白提取率與提取液色澤)與各影響因素之間的回歸方程，得出最優(yōu)提取條件為提取溫度40.8℃、液料比12:1(mL/g)、pH10.5、輔助劑用量0.5%，此條件下米糠蛋白理論提取率為60.4%，提取液色澤理論值(L值)56.7；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明蛋白提取率59.5%，提取液色澤L值58.1，證明優(yōu)化結(jié)果是可靠的。

米糠蛋白；提??；響應(yīng)面分析；優(yōu)化

我國(guó)是稻谷生產(chǎn)大國(guó)，年產(chǎn)量在1.8億噸以上，稻米加工副產(chǎn)物——米糠占稻谷質(zhì)量的6%～8%，年產(chǎn)量也在1000萬噸以上。米糠中脂肪含量14%～24%(以不飽和脂肪酸為主)，蛋白質(zhì)含量14%～20%，是一種優(yōu)質(zhì)的油料資源與蛋白資源[1]。米糠蛋白的必需氨基酸完全，生物效價(jià)達(dá)2.0～2.5，消化率達(dá)90%，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的植物蛋白[2]。尤其是米糠蛋白還具有低過敏性特點(diǎn)，可作為低過敏性蛋白原料用在嬰幼兒食品中[3]。但我國(guó)整體米糠深加工水平不高，絕大多數(shù)米糠被用作低附加值的飼料，有的甚至作為廢料，因此亟需開展米糠的深加工技術(shù)研究。

米糠在提取米糠油后，副產(chǎn)品脫脂米糠(或稱米糠粕)中含有約20%的蛋白質(zhì)，可用來進(jìn)一步開發(fā)米糠蛋白。米糠中的蛋白質(zhì)主要是清蛋白和球蛋白，這兩種可溶性蛋白質(zhì)約占70%。天然狀態(tài)下，米糠蛋白與植酸、半纖維素等結(jié)合在一起，妨礙了它的消化吸收。因此為了提高米糠蛋白的利用價(jià)值，宜將其從天然體系中提取出來。

目前，米糠蛋白提取常用的方法有堿提法、酶法和物理法，一般認(rèn)為堿提法具有成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。然而堿法存在的最主要問題是蛋白提取率偏低與產(chǎn)品色澤較差的問題，影響因素主要包括提取溫度、pH值、液料比以及蛋白提取輔助劑等，這些因素對(duì)以上兩個(gè)指標(biāo)的影響或協(xié)同或拮抗。本實(shí)驗(yàn)采取堿提法提取米糠粕蛋白，并采用中心組合試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化米糠蛋白的提取工藝參數(shù)，為深入了解各因素的影響程度，并開發(fā)出理想的蛋白產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫米糠粕為實(shí)驗(yàn)室自制。

氯化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CS501型超級(jí)恒溫器 重慶試驗(yàn)設(shè)備廠；90-2型恒溫磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠；玻璃夾套酶反應(yīng)器 定制；PHS-2C型精密酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；ZOPR-52D冷凍離心機(jī) 日本Hitachi Koki公司；UV-2800型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；WB-2000IXA型全自動(dòng)測(cè)色色差儀 北京新恒能分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠的脫脂預(yù)處理

新鮮米糠先用60～90℃沸程石油醚以2:1比例浸提全脂米糠，中間換溶劑4～5次，然后改用30～60℃沸程石油醚浸提，傾去溶劑，室溫下?lián)]干溶劑，并粉碎過60目篩即為米糠粕原料，封好4℃儲(chǔ)藏備用。經(jīng)測(cè)定，其中蛋白含量為17.1%。

1.3.2 米糠粕蛋白提取

取20g米糠粕置于玻璃夾套酶反應(yīng)器中，按比例加入一定量溶有輔助劑的蒸餾水，攪拌均勻，并用1mol/L氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至設(shè)定值，同時(shí)設(shè)定水浴溫度并不斷磁力攪拌，在預(yù)設(shè)定提取時(shí)間結(jié)束后，離心分離，收集上清液，測(cè)定上清液的體積與蛋白質(zhì)濃度，以及提取液的色度。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

固體樣品采用GB 5511—1985《微量凱氏定氮法》測(cè)定；液體樣品采用福林-酚法測(cè)定。

1.3.4 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

1.3.5 蛋白提取液色度測(cè)定

色度分析采用食品工業(yè)中常用的L、a、b值均勻色空間表色系統(tǒng)。L值代表亮度(白—黑)，其值越小表明越暗，L值與米糠提取過程中褐變程度有關(guān)[7]。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察提取溫度、pH值、液料比以及蛋白提取輔助劑用量對(duì)米糠粕蛋白提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及水平，以蛋白提取率與提取液色度兩個(gè)指標(biāo)為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析(response surface analysis，RSA)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定提取最優(yōu)工藝條件。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)兩次，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)處理過程中各自變量的水平轉(zhuǎn)換為無因次代碼表示：

式中：為自變量的代碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；X0為自變量中心水平處真實(shí)值；ΔXi為步長(zhǎng)。

數(shù)據(jù)處理采用Design Expert軟件，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次方程回歸擬合得到各次項(xiàng)系數(shù)。在RSA給出的最優(yōu)條件下通過實(shí)驗(yàn)證明預(yù)測(cè)的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

在pH10、液料比1:10、輔助劑用量0.2%、提取時(shí)間2h的條件下，研究提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖1可知，在溫度25℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率約48%，隨著提取溫度的上升，蛋白質(zhì)的提取率不斷上升，在提取溫度45℃附近時(shí)，提取率達(dá)到最大值(59%)，當(dāng)提取溫度進(jìn)一步升高時(shí)，提取率又呈下降趨勢(shì)。所以，提取溫度控制在45℃左右。

圖1 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on protein extraction

2.1.2 液料比對(duì)提取率的影響

圖2 液料比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of solvent to material ratio on protein extraction

在pH10、提取溫度40℃、輔助劑用量0.2%、反應(yīng)時(shí)間2h條件下，研究不同液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖2可知，在液料比4:1時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率比較低，僅為37%左右，隨著液料比的上升，蛋白質(zhì)的提取率不斷上升，在液料比8:1附近時(shí)，提取率趨于最大，進(jìn)一步增加液料比對(duì)提取率影響不大。

2.1.3 pH值對(duì)提取率的影響

在液料比8:1、提取溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間2h、輔助劑用量0.2%條件下，研究不同pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖3可知，在pH7.8時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率比較低，僅為36.7%，提取率隨pH值上升而上升，在pH10.2時(shí)提取率達(dá)到45.6%。但當(dāng)pH值進(jìn)一步升高時(shí)，提取率雖然繼續(xù)上升，但蛋白提取液顏色急劇褐變，且溶液變黏稠，難以實(shí)現(xiàn)后續(xù)分離。所以，在反應(yīng)過程中，應(yīng)該控制pH10左右。

圖3 pH值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH on protein extraction

2.1.4 輔助劑用量對(duì)提取率的影響

圖4 輔助劑用量對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of auxiliary agent amount on protein extraction

米糠中植酸含量相當(dāng)高，且往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，影響了蛋白質(zhì)的溶出[8-9]，且米糠中的色素以及蛋白提取過程中褐變反應(yīng)的發(fā)生對(duì)米糠蛋白的色澤也不利[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中輔助劑的使用能很大程度上解決這兩方面的問題[12-13]。在pH10、提取溫度40℃、液料比10:1、反應(yīng)時(shí)間2h條件下，研究不同輔助劑用量(以米糠質(zhì)量為參考值，m/m)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖4可知，在不加入輔助劑時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率約47%，隨著輔助劑用量的增大，蛋白提取率有增大趨勢(shì)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中觀察到蛋白提取液的顏色有明顯改善?？紤]到添加效果、添加安全用量與節(jié)約成本等因素，輔助劑用量在0.4%左右為宜。

2.2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù)

2.2.1 模型的建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design Expert軟件對(duì)溫度、液料比、pH值、輔助劑用量4個(gè)因素分別在5個(gè)水平上進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察的指標(biāo)為蛋白提取率與提取液色度值。共有31個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括16個(gè)析因點(diǎn)，7個(gè)中心點(diǎn)和8個(gè)軸向點(diǎn)。軸向點(diǎn)代表了每個(gè)獨(dú)立變量的極值水平；中心點(diǎn)代表中心水平，重復(fù)7次以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。響應(yīng)面分析因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and their levels of central composite rotational experimental design

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Trials of central composite rotatable design and their results

續(xù)表2

由Design Expert軟件分別對(duì)蛋白提取率與提取液色度結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到Y(jié)1(蛋白提取率)及Y2(提取液色澤)對(duì)自變量的多項(xiàng)式模型方程。

對(duì)以上兩模型分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3、4所示。

表3 蛋白提取率(Y1)回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of protein extraction (Y1) model

表4 提取液色度(Y2)的回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of color of extraction solution (Y2) model

由表3、4可知，Y1和Y2模型方程的P值均小于0.001，表明模型方程均極顯著。兩模型方程的決定系數(shù)(R2)分別為0.872與0.813，一般認(rèn)為R2大于0.80表明方程的擬合情況較好[14-16]。因此可認(rèn)為以上兩模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的模擬結(jié)果均良好，用該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)是合理的。

2.2.2 響應(yīng)面分析

以蛋白提取率為指標(biāo)，從表3可看出，3個(gè)一次項(xiàng)(溫度、液料比和pH值)、兩個(gè)二次項(xiàng)(溫度和液料比)和一個(gè)交互項(xiàng)(液料比與輔助劑用量交互作用)達(dá)顯著水平(P＜0.05)。因此，可認(rèn)為所選取的4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率均存在影響。以溫度與液料比對(duì)提取率的影響為例，從圖5的響應(yīng)面分析可看出，固定pH值與輔助劑用量水平，在考察范圍內(nèi)蛋白提取率隨著液料比的增大而線性增加，而隨著溫度的變化呈二次函數(shù)變化關(guān)系，即先增加后減小，約40℃處為轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

以提取液色澤為指標(biāo)，從表4可看出，3個(gè)一次項(xiàng)(液料比、pH值和輔助劑用量)達(dá)顯著水平，所有二次項(xiàng)和交互項(xiàng)均不顯著，因此可認(rèn)為在考察范圍內(nèi)溫度對(duì)色澤是沒有顯著影響的。以pH值和液料比對(duì)提取液色澤的影響為例，從圖6的響應(yīng)面分析可看出，提取液色澤(L值)隨著pH值的升高而線性減小(L值減小表明顏色加深)，隨液料比的增加而線性增大。

圖5 Y1＝f(X1,X2)對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 3D response surface contour plots for the effects of X1 and X2 on Y1 (X3 ＝ 10,X4＝ 0.4%)

圖6 Y2＝f(X2,X3)對(duì)色澤影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.6 3D response surface contour plots for the effects of X2 and X3 on Y2 (X1＝40, X4＝0.4%)

2.2.3 最優(yōu)條件的求解及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)米糠蛋白提取而言，要求高提取率的同時(shí)，提取液的顏色較淺為宜(L值較大)。利用Design Expert軟件的多目標(biāo)同步優(yōu)化功能，得到米糠蛋白的最優(yōu)提取工藝條件為溫度40.8、液料比12:1、pH10.5、輔助劑用量0.5%，在此條件下蛋白提取率理論值為60.4%、色度L值為56.7，結(jié)果均比較理想。

對(duì)最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。按上述最優(yōu)條件進(jìn)行米糠蛋白提取，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)測(cè)蛋白提取率平均值為58.2%，色澤L值為57.9，與預(yù)測(cè)值的誤差分別為3.8%和2.1%，說明采用RSA法優(yōu)化得到的實(shí)驗(yàn)參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

采用堿提工藝進(jìn)行米糠粕蛋白的提取實(shí)驗(yàn)，考察溫度、液料比、pH值以及輔助劑使用量對(duì)蛋白提取率和提取液色澤的影響，采用中心組合試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析方法對(duì)以上條件進(jìn)行優(yōu)化，得到米糠蛋白最佳提取工藝條件為溫度40.8℃、液料比12:1(mL/g)、pH10.5、輔助劑用量0.5%，在此條件下蛋白提取率與提取液色度能同時(shí)取得理想的效果，提取率理論值60.4%、色澤L值56.7。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，提取率與提取液色澤誤差分別為3.8%和2.1%，說明優(yōu)化結(jié)果真實(shí)可信。

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Optimization of Key Factors for Protein Extraction from Rice Bran

GUAN Xiao，JIN Zhou-yun，JIN Jing，HUANG Cheng-long，JIN Long

(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

There usually are some shortcoming such as low protein extraction ratio and dark color during the rice bran protein extraction. The factors which caused these problems include extraction temperature, pH, ratio of solvent to material, and auxiliary agent amount. The central composite experiments and response surface analysis were used to optimize these factors.The experiments results showed that 60.4% protein extraction ratio and extraction supernatant color (Lvalue) 56.7 were obtain under the optimized condition of temperature 40.8℃, ratio of solvent to material 12, pH 10.5, and auxiliary agent amount 0.5%.The actual protein extraction ratio was 59.5%, andLvalue 58.1, which showed that the optimized conditions were accurate.

rice bran protein；extraction；response surface analysis；optimization

TQ464.7

A

1002-6630(2012)10-0024-05

2011-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101348；31000780)；上海市晨光計(jì)劃項(xiàng)目(09CG50)

管驍(1979—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ芘c營(yíng)養(yǎng)。E-mail：gnxo@163.com