劉長江，賈莎莎，許金光

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

響應面法優(yōu)化軟棗獼猴桃蛋白水解及多肽的抗氧化研究

劉長江，賈莎莎，許金光

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

以酶解產(chǎn)物清除羥基自由基能力為指標，選用堿性蛋白酶為水解酶，利用響應曲面法優(yōu)化軟棗獼猴桃蛋白最佳酶解工藝條件并制取抗氧化肽?？疾炱渌舛群颓宄实南嚓P性。結果表明：堿性蛋白酶最佳酶解工藝為溫度50℃、pH9、加酶量4000U/g、酶解時間3h，此時水解度達到最大值為25.08%。在此條件下將軟棗獼猴桃蛋白分別水解1、2、3、4、5h得到肽混合物進行抗氧化活性分析，得到其對羥自由基清除率分別為18.69%、24.67%、28.04%、25.82%、26.65%。當酶解時間為3h時，此時抗氧化肽的羥自由基清除率最高。

軟棗獼猴桃；抗氧化肽；水解度；清除率

軟棗稱猴桃(Actinidia argutaSieb.et Zucc.)，別名軟棗子，主要分布在東北、華北、山東、西北及長江流域，其中，東北南部山區(qū)較多見[1]。是大藤木，皮淡灰褐色，片裂，葉互生，稍厚革質(zhì)或紙質(zhì)，卵圓形，其果實無污染、口感好，為營養(yǎng)豐富的保健食品和老弱病人的療效食品，是具有開發(fā)前景的第3代水果之一[2]。棗獼猴桃中含有蛋白質(zhì)、糖類、黃酮類、維生素、氨基酸、礦質(zhì)元素等多種功能活性成分[3]，對軟棗獼猴桃的研究報道也越來越多[4-6]。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì), 很早以前就有報道稱肽可被完整吸收進入血液，對機體的功能和狀態(tài)起到積極作用，有利于機體健康[7-8]。近年來，通過酶法水解來提高蛋白食品的加工性能、營養(yǎng)性以及釋放出生理保健功能的多肽已經(jīng)受到廣泛重視。人們發(fā)現(xiàn)小肽在人體吸收代謝過程中具有重要生理功能，如參與機體免疫調(diào)節(jié)、降血壓、促進礦物質(zhì)吸收及抗血栓等[9-10]。蛋白質(zhì)酶解可以生成小分子質(zhì)量的肽類，不但提高了原蛋白的營養(yǎng)價值，而且具有抗氧化、降血壓、抗菌等多種活性，其中抗氧化性更是科研工作者研究的熱點[11]。劉立芳等[12]利用中性蛋白酶酶解小麥蛋白，得到了具有較強的抗氧化活性的多肽。目前食品工業(yè)中使用的抗氧化劑多數(shù)為人工合成，隨著人們對食品添加劑安全性的關注不斷提高，篩選具有抗氧化活性的天然資源已成為食品科學研究的新趨勢[13]。因此，開發(fā)軟棗獼猴桃蛋白多肽及其研究制取工藝具有一定的臨床意義和經(jīng)濟價值。

本實驗根據(jù)酶水解原理和響應曲面統(tǒng)計法(response surface methodology，RSM)對制取軟棗獼猴桃蛋白多肽的工藝進行研究[14]。以水解度(degree of hydrolysis，DH)為衡量指標，并以酶濃度、酶解時間、酶解溫度和pH值為4因素進行優(yōu)化設計，同時對酶解產(chǎn)物清除羥基自由基的能力進行分析。為軟棗獼猴桃蛋白的優(yōu)化水解提供一定的基礎，也為研究一定功能的活性肽和功能食品基料提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃粗蛋白(自制，粗蛋白含量23.35%)；堿性蛋白酶、2-脫氧-D-核糖 美國Sigma公司；甘氨酸、茚三酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PB-10 pH酸度計 德國Sartorius 公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；HD-5電腦紫外檢測儀 上海滬西分析儀器廠；高速冷凍離心機。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃蛋白的提取工藝

工藝流程：軟棗獼猴桃鮮果→勻漿→加水、調(diào)pH8，45℃水浴2h→離心(6000r/min、15min)→取上清液→調(diào)pH值，靜置→離心取沉淀，水洗至中性→冷凍干燥得軟棗獼猴桃粗蛋白。

1.3.2 軟棗獼猴桃蛋白多肽的制備工藝流程

自制軟棗獼猴桃粗蛋白→加水→加熱處理(30min、70℃)→冷卻→調(diào)pH值，加酶液→恒溫水解(50℃)→冷卻至室溫→滅酶(70℃、5min)→離心(4000r/min)→軟棗獼猴桃蛋白水解液(軟棗獼猴桃蛋白多肽)

1.3.3 氨基酸態(tài)氮測定

采用茚三酮顯色法[15]。

1.3.4 水解度的計算[16]

取樣品溶液1mL，加入pH5.4的醋酸緩沖溶液和茚三酮顯示液各1mL混勻后，在100℃沸水水浴15min后，自來水冷卻。放置5min后，加入3mL 60%乙醇溶液稀釋，搖勻后在570nm處測吸光度。將

吸光度與甘氨酸標準曲線對照，得出氨基酸態(tài)氮含量。

式中：AN為水解液中氨基酸態(tài)氮的含量/%；TN為原料中粗蛋白總氮的含量/%。

1.3.5 單因素試驗

蛋白酶解一般受到加酶量、酶解溫度、pH值、酶解時間等影響。本試驗將軟棗獼猴桃蛋白與蒸餾水按一定比例溶解，初始提取條件為加酶量4000U/g、pH9、酶解溫度50℃、酶解時間3h，在此基礎上測定不同單因素條件下，軟棗獼猴桃蛋白酶解水解度的變化。

單因素水平：加酶量2000、3000、4000、5000、6000U/g；酶解溫度30、40、50、60、70℃；pH7、8、9、1 0、1 1；酶解時間1、2、3、4、5 h。

1.3.6 堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白的響應曲面優(yōu)化設計

根據(jù)單因素試驗，選取影響酶解效果的酶解時間、溫度、pH值、加酶量4個因素。利用Minitab 15軟件，采用Box-Behnken中心組合試驗設計，以蛋白質(zhì)的水解率為評價指標，確定堿性蛋白酶提取軟棗獼猴桃蛋白多肽的最優(yōu)條件，試驗因素水平編碼見表1。

表1 堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白的響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.7 軟棗獼猴桃蛋白多肽清除羥自由基的測定[17-20]

為測定軟棗獼猴桃蛋白多肽清除羥自由基的能力，利用Feton體系產(chǎn)生的羥自由基，通過分析自由基對2-脫氧-D-核糖分子的氧化、破壞情況來確定樣品的存在是否對羥基自由基具有清除作用，保護2-脫氧-D-核糖分子不被羥自由基氧化、破壞。具體測定方法：取0.2mL FeSO4-EDTA混合液(10mmol/L)于試管中，加入0.05mL 2-脫氧-D-核糖溶液(10mmol/L)，然后加適量軟棗獼猴桃蛋白多肽，用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)定容至1.8mL，再加入0.2mL H2O2(10mmol/L)，混合后置于37℃恒溫水浴中反應1h，然后加入質(zhì)量分數(shù)2.8%的三氯乙酸(TCA)溶液1.0mL，質(zhì)量分數(shù)1.0%的硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，混勻，置沸水浴反應15min，冷卻后用在波長532nm處測吸光度。對照管除不加酶解液外，其余相同，所測吸光度(A0)，空白管以磷酸緩沖液調(diào)零，用清除率表示清除能力。式中：A0為不加酶液測的空白值；A為樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶提取軟棗獼猴桃蛋白抗氧化肽的單因素試驗

2.1.1 加酶量對水解度的影響

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著加酶量的增加，軟棗獼猴桃蛋白水解度逐漸升高。當加酶量達到一定程度時，大部分蛋白酶解，此后隨著加酶量的增大，水解度無顯著提高。堿性蛋白酶在水解軟棗獼猴桃蛋白時，在加酶量4000U/g時，軟棗獼猴桃蛋白多肽水解度的上升趨勢趨于平緩，則確定堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適加酶量為4000U/g。

2.1.2 pH值對水解度的影響

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

由圖2可知，pH值對水解效果的影響顯著。堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白時，pH值從7增加到9時，蛋白水解度逐漸增大；而當pH值從9增加到11時，軟棗獼猴桃蛋白的水解度逐漸減小，pH值為9時水解度達到最高。因此，確定堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適pH值為9。

2.1.3 溫度對水解度的影響

圖3 酶解溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

從圖3可知，酶解溫度對水解效果的影響顯著。堿性蛋白酶在水解軟棗獼猴桃蛋白時，溫度從30℃增加到50℃，軟棗獼猴桃蛋白水解度升高顯著，且升趨勢明顯；而當溫度繼續(xù)升高，則蛋白提取率逐漸下降，溫度50℃時酶解得到的軟棗獼猴桃蛋白水解度達到最高。因此，確定堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適溫度為50℃。

2.1.4 酶解時間對水解度的影響

圖4 酶解時間對水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

從圖4可以看出，酶解時間對水解度有一定影響。酶解軟棗獼猴桃蛋白時，隨時間的延長，軟棗獼猴桃多肽的水解度逐漸增多，當達到一定時間后，軟棗獼猴桃多肽的水解度隨時間的延長而趨于平緩。這是因為隨著酶解的進行，軟棗獼猴桃蛋白含量逐漸減少。堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白時，3h以后，水解度變化逐漸趨于平緩，因此，選擇堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適時間是3h。

2.2 酶解軟棗獼猴桃蛋白的響應面試驗數(shù)據(jù)分析

2.2.1 正交試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上進行響應面試驗，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，以相關性密切的4個因素

酶解溫度、加酶量、pH值和酶解時間為自變量，水解度為響應值對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，設計方案及結果分析表見表2。

表2 軟棗獼猴桃蛋白酶解工藝優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests

根據(jù)表2結果，利用Minitab 15軟件分析得到軟棗獼猴桃蛋白的水解度對編碼自變量的二次多項式回歸模型為：Y＝25.05－0.41A－0.47B－0.337C＋0.37D－0.52AB＋0.29AC＋0.69AD＋0.89BC－0.08BD－0.12CD－1.26A2－2.12B2－3.28C2－5.53D2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression model

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Significance test for each item in the regression model

由表3、4可知，該模型的預測系數(shù)為R2(預測決定系數(shù))＝0.9469，相對于校正決定系數(shù)R2Adj＝0.9799擬合度好，決定系數(shù)為R2＝0.9907，說明該模型的擬合性非常好，可以用于模型分析。

從表4可知，A、B、D、A D、B C、A2、B2、C2、D2差異極顯著；C、AB為顯著項；BD、CD為不顯著項。失擬項的P＝0.058，說明失擬項不顯著，模型的擬合性好。因此可利用該回歸模型對試驗結果進行優(yōu)化分析，確定軟棗獼猴桃蛋白水解的最佳工藝條件。2.2.2 響應面分析及優(yōu)化

圖5 各兩因素交互作用對水解度影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of the cross-interaction among factors on the degree of hydrolysis

由圖5可知，響應面分析方法的圖形是特定的響應面對應的因素加酶量、時間、pH值、溫度構成三維空間。響應面分析圖上可以看出4因素值選擇合理，驗證了實驗的正確性。運用 Minitab 軟件的響應優(yōu)化器對試驗結果進行優(yōu)化，由二次多項回歸方程來預測堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白多肽水解度最高的提取條件。經(jīng)過軟件分析得出最優(yōu)條件為pH8.9、加酶量3868.7U/g、酶解溫度50.3℃、酶解時間2.9h，該條件下軟棗獼猴桃蛋白多肽的水解度的預測值為該條件下軟棗獼猴桃蛋白多肽的水解度的預測值為25.12%。根據(jù)實際生產(chǎn)操作將預測條件優(yōu)化為pH9、加酶量4000U/g、酶解溫度50℃和酶解時間3h。

2.3 軟棗獼猴桃蛋白多肽羥自由基清除能力

以羥自由基清除率為衡量指標，采用酶解的最優(yōu)條件為加酶量4000U/g、pH9、酶解溫度50℃，分別測定酶解1、2、3、4、5h時，軟棗獼猴桃蛋白多肽的羥自由基清除率，結果見表5。

表5 羥自由基清除率Table 5 Hydroxyl radical-scavenging rates

由表5可見，羥自由基清除率隨著酶解時間的增加而增大，當水解3h時清除率達到最高值，而繼續(xù)酶解后清除率并沒有依次增高，這種現(xiàn)象可能是因為具有較高的肽在接下來的反應中被水解。綜合反應來看，隨著水解時間的延長，羥自由基的清除率有所上升，這是由于具有抗氧化活性的肽分子質(zhì)量一般較小[21]。在一定范圍內(nèi)水解時間越長，肽平均的分子質(zhì)量就會越小，可能具有抗氧化活性的肽就越多，因此在實驗中水解4、5h時出現(xiàn)了較高的清除率。但實驗中發(fā)現(xiàn)酶解3h時得到軟棗獼猴桃蛋白多肽的羥自由基清除率為28.04%，抑制率最高，同時水解度也達到了最高值25.08%。因此采用酶解3h作為制備抗氧化肽的最佳水解時間。

3 結 論

在水解軟棗獼猴桃蛋白制備抗氧化肽的工藝中，pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時間對水解度均有一定影響。通過單因素試驗及響應曲面分析方法，以水解度為衡量指標，確定了最優(yōu)提取工藝參數(shù)pH9、酶解溫度50℃、酶解時間3h、加酶量4000U/g，在此條件下將軟棗獼猴桃蛋白分別水解1、2、3、4、5h得到肽混合物進行抗氧化活性分析，得到其對羥自由基的清除率分別為18.69%、24.67%、28.04%、25.82%、26.65%。因此選擇3h作為水解制備抗氧化肽的時間，此時抗氧化肽的羥自由基清除率最高。

[1] 林志堅, 阮立為, 郭旭. 軟棗稱猴桃的化學成份及其綜合利用[J]. 中國林副特產(chǎn), 1995(2): 25-126.

[2] 王曉東, 段全猛. 軟棗獼猴桃的利用與栽培[J]. 特種經(jīng)濟動植物, 2006(2): 50-56.

[3] 張?zhí)m杰, 辛廣, 于連等. 軟棗獼猴桃果中類SOD的提取與研究[J]. 食品科技, 2010, 35(6): 204-209.

[4] 黃岳, 樸一龍, 王琳. 長白山區(qū)野生軟棗獼猴桃種質(zhì)RAPD分析[J].延邊大學農(nóng)學學報, 2009, 31(2): 119-123.

[5] 王菲, 許金光, 劉長江. 軟棗獼猴桃中的功能保健成分及其在食品加工中的應用[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(8): 421-423.

[6] 辛廣, 張博, 馮帆, 等. 軟棗獼猴桃果實香氣成分分析[J]. 食品科學,2009, 30(4): 230-232.

[7] KITTS D D, WEILER K. Applications of bioprocesses used in isolation an recovery[J]. Current Pharmaceutical Design, 2003, 9(16): 1309-1323.

[8] RAO A, SHALLO H E, RERIESONAND A, et al. Characterization of soy protein concentrate produced by membrane ultrafiltration[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(4):1412-1418.

[9] SYLVIC F G, YVES P, DIANC S. Immunomodulatory peptides obtained by the enzymatic hydrolysis of whey protein[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(11): 1315-1323.

[10] ESTHER M, AMPARO A, REYES B, et a1. Casein phosphope tides released by simulated gastrvintestinal digestion of infant formulas and their potential role in mineral binding[J]. International Dairy Journal,2006, 16(9): 992-1000.

[11] 李珂, 楊秀華, 扈麟, 等. 響應曲面法骨膠原蛋白酶解條件的優(yōu)化[J].食品科學, 2009, 30(7): 135-136.

[12] 劉立芳, 徐懷德. 中性蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報, 2008, 17(6): 281-285.

[13] 宋曉燕, 高彥祥, 袁芳. 響應面法優(yōu)化羊胎粉中抗氧化多肽制備工藝的研究[J]. 食品科技, 2008, 33(11): 237-238.

[14] 汪志慧, 孫智達, 謝筆鈞. 響應曲面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素[J]. 食品科學, 2011, 32(4): 65-67.

[15] 茚三酮顯色法測定氨基酸含量[EB/OL]. (2010-7-10) [2011-04-15].http://www.docin.com/p-63536472.htmL.

[16] 趙新淮, 馮志彪. 蛋白質(zhì)水解物水解度測定的研究[J]. 食品科學,1994, 15(11): 65-67.

[17] 劉長江, 曹向宇, 劉劍利. 麥麩多肽的酶法制備及其特性研究[J]. 食品工業(yè), 2009(1): 34-36.

[18] 杜國榮. 獼猴桃(Actinidia)、柿(Diospyros kakiL.)和蘋果(Malus domesticaBorkh.)果實的抗氧化能力及其抗氧化活性成分的分析[D].楊凌: 西北農(nóng)林科技大學, 2009.

[19] 陳美珍, 余杰, 郭慧敏. 大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究[J]. 食品科學, 2002, 23(1): 43-46.

[20] HALLIWELL B, GUTTERIDGE J M, ARUOMA O I. The deoxyribose method: a simple of “test-tube” assay for determination of rate constants for reaetions hydroxyl radieals[J]. Anal Biochem, 1987, 165(1): 215-219.

[21] 黃艷春, 劉張虎, 熊善柏. 酶解鰱肉制取 ACE 抑制肽工藝條件的優(yōu)化[J]. 食品科學, 2007, 28(2): 181-184.

Optimization of Enzymatic Hydrolysis for Protein fromActinidia argutaSieb. et Zucc by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity of Polypeptides

LIU Chang-jiang*，JIA Sha-sha，XU Jin-guang

(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Taking hydroxyl radical-scavenging capacity of hydrolysates as the index, the optimal hydrolysis process for the protein fromActinidia argutaSieb. et Zucc by alkaline protease was explored by response surface methodology (RSM) to prepare antioxidant polypeptides. Meanwhile, the correlation between the degree of hydrolysis (DH) and the hydroxyl radical-scavenging capacity of polypeptides was examined. The results showed that the optimal hydrolysis parameters of alkaline protease enzyme were hydrolysis temperature of 50 ℃, hydrolysis pH of 9, enzyme addition amount of 4000 U/g, and hydrolysis time of 3 h. Under the optimal hydrolysis condition, the DH was up to 25.08%. In addition, the hydroxyl radical-scavenging rates of the hydrolysis products from the protein ofActinidia argutasubjected to hydrolysis for 1, 2, 3, 4 h and 5 h at the optimal hydrolysis conditions were 8.69%, 24.67%, 28.04%, 25.82% and 26.65%. The product achieved at 3 h hydrolysis revealed the strongest hydroxyl radical-scavenging rate.

Actinidia argutaSieb. et Zucc；anti-oxidant peptides；hydrolysis degree；clearance rate

TS255.36

A

1002-6630(2012)10-0033-06

2011-05-17

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903013)

劉長江(1955—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：liucj597@sohu.com