劉淑敏，王 娟，黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641)

影響綠茶浸提液與膽酸鹽結(jié)合的因素研究

劉淑敏，王 娟，黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641)

在體外模擬人體消化環(huán)境，通過(guò)測(cè)定在不同pH值、離子強(qiáng)度、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和尿素濃度條件下，綠茶浸提液在體外對(duì)?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的結(jié)合能力，比較這些因素對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響。結(jié)果表明，pH值、尿素濃度對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽有顯著性影響(P≤0.05)，離子強(qiáng)度對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽影響不顯著(P≥0.05)。

綠茶浸提液；膽酸鹽；結(jié)合；影響因素

近年來(lái)，冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病成為威脅全人類健康的嚴(yán)重疾病之一，而高膽固醇是冠心病的主要誘因，保持膽固醇水平正常對(duì)于降低冠心病發(fā)生率具有重要意義。膽酸鹽是指來(lái)自人體和動(dòng)物膽汁具有甾核結(jié)構(gòu)的一類兩性大分子，是人體合成膽固醇的前體物質(zhì)[1-2]。國(guó)內(nèi)外大量體外實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查顯示，茶葉具有降血脂功能[3-7]。關(guān)于茶葉降血脂機(jī)理，目前尚無(wú)明確定論。有學(xué)者認(rèn)為，飲茶后，茶中的功能性成分在腸道內(nèi)能與膽酸鹽結(jié)合，影響脂類消化吸收，同時(shí)介入肝腸循環(huán)，使膽酸鹽排出體外，以促使肝臟中膽固醇不斷轉(zhuǎn)化為膽酸鹽，達(dá)到降血脂目的[8-11]。但是由于茶葉是多種物質(zhì)的復(fù)合體，與膽酸鹽作用方式多樣，對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力影響因素較多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外模擬人體消化環(huán)境的實(shí)驗(yàn)，研究不同因素對(duì)綠茶浸提液與膽酸鹽結(jié)合能力的影響，旨在探討影響茶葉與膽酸鹽結(jié)合的主要相互作用力，從機(jī)理方面探討茶中功能性成分與其結(jié)合膽酸鹽能力及其降血脂的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

綠茶，產(chǎn)地廣西、福建、云南。

牛磺膽酸鈉(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)、膽酸鈉(SC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 日本TCI公司；胰酶(蛋白酶4080U/g、脂肪酶33600U/g、淀粉酶91000U/g) 四川貝奧生物制藥有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 深圳國(guó)華儀器廠；TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 綠茶浸提液的制備

稱取20g綠茶，加入240mL蒸餾水，于80～85℃浸提60min，100目過(guò)濾，定容至250mL。

1.2.2 膽酸鹽含量的比色測(cè)定

分別取樣液(或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液)2.5mL于具塞試管中，加入7.5mL 60%的硫酸，于70℃水浴20min，取出冰浴5min，于387nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液中膽酸鹽的濃度[12-13]。

1.2.3 人體胃腸道環(huán)境模擬

胃環(huán)境模擬：取一定量樣品，加入1mL 0.01mol/L的鹽酸溶液，在37℃恒溫振蕩消化1h。

腸環(huán)境模擬：以0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)胃環(huán)境模擬后樣品液pH值為6.3，隨后加入4mL 10mg/mL胰酶，(胰酶以pH6.3的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，在37℃恒溫振蕩消化1h。

1.2.4 茶多酚含量測(cè)定

采用GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》中方法測(cè)定。

1.2.5 影響綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的因素研究

1.2.5.1 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定膽酸鹽濃度為0.3mmol/L。分別稱取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g PVP，加入24mL綠茶浸提液，37℃恒溫振蕩30min， 5000r/min離心10min。分別取1mL上清液，經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后加入4mL 膽酸鹽溶液(SC、STC、SGC濃度均為0.3mmol/L，用pH6.3、0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，恒溫振蕩1h，4000r/min離心20min。測(cè)定上清液中的膽酸鹽含量[14]。

1.2.5.2 pH值對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

取10mL綠茶浸提液于100mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值為6.24，隨后加入40mL 10mg/mL胰酶，恒溫振蕩消化1h。將上述經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理的綠茶浸提液平均分成5份，分別調(diào)節(jié)其pH值為4.92、5.29、6.24、7.38、8.04，最后以相應(yīng)的磷酸緩沖溶液定容。取6mL經(jīng)調(diào)節(jié)pH值后的處理液，每個(gè)樣品中加入4mL膽酸鹽溶液(SC、STC、SGC濃度均為0.3mmol/L，分別以pH值為4.92、5.29、6.24、7.38、8.04的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，振蕩，離心。測(cè)定上清液中的膽酸鹽含量。

1.2.5.3 離子強(qiáng)度對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

取1mL綠茶浸提液，經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后吸取6mL，每個(gè)樣品中加入4mL膽酸鹽(SC、STC、SGC的濃度設(shè)定為0.3、0.6、1mmol/L，分別以pH6.3，濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/L的不同離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液配制)，振蕩，離心。測(cè)定上清液中的膽酸鹽含量。

1.2.5.4 尿素對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

將經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理的綠茶浸提液平均分成兩份，其中一份加入一定量尿素(1.5mmol/L)。取6mL上述試液，每個(gè)樣品中加入4mL膽酸鹽溶液(SC、STC、SGC濃度設(shè)定為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/L，分別以pH6.3的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，恒溫振蕩，離心。對(duì)照為取6mL未加入尿素試液，其余操作相同。測(cè)定上清液中的膽酸鹽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVP對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

PVP可定量吸附茶多酚，其用量越大，茶多酚去除率越大。其吸附機(jī)理為：茶多酚分子中的活性氫基團(tuán)可與PVP形成氫鍵而導(dǎo)致大分子的形成，由于PVP不溶于水，茶多酚分子就通過(guò)氫鍵不斷沉積到PVP上而被除去。用PVP處理綠茶浸提液，可得到不同茶多酚含量的綠茶浸提液。在PVP用量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g時(shí)，茶多酚含量依次為26.95%、23.46%、16.2%、9.31%、4.75%、4.6%。經(jīng)不等量PVP處理后的綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的能力均存在顯著性差異(P≤0.05)，PVP用量為0g時(shí)最大，PVP用量為1g時(shí)最??；PVP處理后綠茶浸提液中茶多酚含量與其結(jié)合膽酸鹽的關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 PVP對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.1 Effect of PVP on the adsorption of green tea extract to bile salts

如圖1所示，綠茶浸提液中所含茶多酚含量與其結(jié)合STC、SGC、SC的能力呈顯著性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.976、0.984、0.981。表明茶多酚與綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力有關(guān)，綠茶浸提液中茶多酚含量越高，其結(jié)合膽酸鹽的能力越強(qiáng)，茶多酚會(huì)影響膽酸鹽的體內(nèi)代謝，從而起到降血脂作用。

2.2 pH值對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

如圖2所示，綠茶浸提液在pH值為7.38、8.04時(shí)對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力顯著(P≤0.05)強(qiáng)于pH值為4.92時(shí)，而pH值為4.92時(shí)綠茶浸提液對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力顯著強(qiáng)于pH值為6.24時(shí)?？赡茉蚴莗H值會(huì)改變綠茶浸提液中功能性成分的水溶性，影響膽酸鹽微團(tuán)的溶解性和陰離子化程度，從而影響膽酸鹽結(jié)合部位的暴露。因?yàn)镾TC、SGC、SC的pKa分別為3.33、6.2、4.98[15]，綠茶浸提液的pKa接近6.5，在pH6.24時(shí)，3種膽酸鹽微團(tuán)溶解性較強(qiáng)，微團(tuán)陰離子化程度較高，結(jié)合位點(diǎn)較多[16]，但弱酸性的綠茶浸提液在此介質(zhì)中的陽(yáng)離子化程度較低，所以綠茶浸提液中功能性成分較難以離子鍵形式與吸附質(zhì)發(fā)生作用。在pH7.38時(shí)，既能保持膽酸鹽微團(tuán)具有較高的陰離子程度，結(jié)合位點(diǎn)多，同時(shí)又可以使綠茶浸提液中功能性成分水溶性增強(qiáng)，生成較多的陽(yáng)離子，使綠茶浸提液對(duì)膽酸鹽表現(xiàn)出最大吸附能力。pH值變化對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力的影響，說(shuō)明綠茶浸提液與膽酸鹽的結(jié)合作用與綠茶浸提液中陽(yáng)離子與膽酸鹽微團(tuán)陰離子之間的靜電離子相互作用有關(guān)。

圖2 不同pH值對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.2 Effect of medium pH on the adsorption of green tea extract to bile salts

2.3 離子強(qiáng)度對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

圖3 不同磷酸鹽離子強(qiáng)度對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.3 Effect of ionic strength on the adsorption of green tea extract to bile salts

如圖3所示，在不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液中綠茶浸提液對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合量不存在顯著性差異(P≥0.05)，表明離子強(qiáng)度對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽不存在顯著性影響，疏水作用對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽無(wú)顯著貢獻(xiàn)。

2.4 尿素對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

圖4 尿素對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.4 Effect of urea concentration on the adsorption of green tea extract to bile salts

為了考察氫鍵作用對(duì)吸附過(guò)程的影響，在有尿素存在下進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。尿素能夠形成氫鍵，并且優(yōu)先在自身與水之間形成氫鍵，影響膽酸鹽微團(tuán)的穩(wěn)定性，促使膽酸鹽的活性基團(tuán)暴露，從而有利于綠茶浸提液中功能性成分與膽酸鹽之間形成氫鍵。尿素存在的情況下綠茶浸提液對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合作用結(jié)果如圖4所示。在膽酸鹽初始濃度較低時(shí)，尿素對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽不存在顯著性影響，而在膽酸鹽初始濃度較高(SC濃度高于0.3mmol/L、STC濃度高于0.7mmol/L、SGC濃度高于0.5mmol/L)時(shí)，尿素對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽存在顯著性影響(P≤0.05)。由此可以推斷氫鍵在3種膽酸鹽吸附到綠茶浸提液表面的過(guò)程中起著一定的作用，可能是由于膽酸鹽中的羥基和茶多酚的酚羥基、咖啡堿的氨基形成氫鍵。

3 結(jié) 論

綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力與茶多酚含量呈顯著性相關(guān)關(guān)系，表明綠茶多酚是綠茶浸提液中結(jié)合膽酸鹽的功能成分，這是綠茶具有降血脂功能的機(jī)理之一。綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力與pH值及尿素顯著相關(guān)，表明靜電作用力和氫鍵作用均是綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的主要相互作用力。綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力與離子強(qiáng)度變化差異不顯著，表明疏水作用力對(duì)綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽無(wú)顯著貢獻(xiàn)，不是主要作用力。

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Factors Influencing the Binding between Green Tea Extract and Bile Salt

LIU Shu-min，WANG Juan，HUANG Hui-hua*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

Through determining the binding capacity of green tea extract to sodium taurocholate, glycocholate and sodium cholate under polyvinylpyrrolidone (PVP), medium pH, ionic strength and ureain vitro, the adsorption behavior of green tea extract to bile salts were compared. The results showed that medium pH and urea concentration had significant effects on binding of green tea extract to bile salts(P≤0.05), but the effect of ionic strength was not obvious(P≥0.05).

green tea extract；bile salts；binding；impact factor

TS201.7

A

1002-6630(2012)05-0029-04

2011-03-02

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B020312005)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010Z1-E221)

劉淑敏(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：liushuminlsm@163.com

*通信作者：黃惠華(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)及農(nóng)產(chǎn)品加工新技術(shù)。E-mail：fehuang@scut.edu.cn