張 帥，陳 懿，董 基，梁巧榮

(肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

黑曲霉固態(tài)發(fā)酵橘皮生產(chǎn)纖維素酶及淀粉酶

張 帥，陳 懿，董 基，梁巧榮

(肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

以橘皮為原料，以黑曲霉AS3.3928為生產(chǎn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中橘皮含量、培養(yǎng)基含水量、接種量及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)纖維素酶和淀粉酶活力的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)最終確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加16g橘皮，并加入5mL無(wú)菌水使培養(yǎng)基初始含水量為64mL/100g，黑曲霉接種量15%，發(fā)酵60h。在此發(fā)酵條件下所產(chǎn)纖維素酶活力可達(dá)1816U/g，淀粉酶活力達(dá)196U/g。結(jié)果表明，利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵橘皮，非常有利于纖維素酶和淀粉酶的生產(chǎn)。

橘皮；黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶；淀粉酶

我國(guó)是柑橘生產(chǎn)大國(guó)，每年都有大量副產(chǎn)物柑橘皮作為廢棄物而扔掉，既浪費(fèi)了資源又污染了環(huán)境。柑橘皮富含果膠、纖維素、可溶性糖及多種維生素和礦物元素，是一種良好的微生物生長(zhǎng)基質(zhì)。目前對(duì)柑橘皮的研究主要集中在內(nèi)含成分的提取方面，對(duì)利用柑橘皮發(fā)酵產(chǎn)酶的報(bào)道極少。單麗君等[1]對(duì)固體發(fā)酵柑橘皮生產(chǎn)飼用復(fù)合酶的菌株進(jìn)行了選育，Ismail[2]對(duì)曲霉和青霉液體發(fā)酵柑橘皮產(chǎn)復(fù)合酶進(jìn)行了研究，戚炯炯等[3]對(duì)宇佐美曲霉固體發(fā)酵柑橘皮生產(chǎn)飼用復(fù)合酶進(jìn)行了研究。

纖維素酶是飼用酶制劑的主要酶類之一，在飼料中與半纖維素酶、果膠酶協(xié)同破壞植物細(xì)胞壁使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)以利于動(dòng)物消化吸收[4-5]。淀粉酶是我國(guó)目前用途最廣泛、產(chǎn)量最大的工業(yè)酶制劑之一，主要應(yīng)用于淀粉加工、紙漿制造、紡織工業(yè)、釀酒及飼料加工業(yè)等領(lǐng)域[6]。本實(shí)驗(yàn)以橘皮為原料，以黑曲霉為生產(chǎn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶，經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件，旨在為酶制劑的生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)，同時(shí)為柑橘皮的綜合利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘皮：四會(huì)砂糖橘，于2009年11月市購(gòu)，洗凈陰干，去瓤取皮，直接干燥法[7]測(cè)得橘皮含水量為68.14%，將橘皮剪碎備用。

氫氧化鈉溶液(200g/L)、檸檬酸鈉緩沖液(0.05mol/L，pH5.5)、Whatman 1號(hào)濾紙條(1.0cm×6.0cm)、DNS試劑、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0mg/mL)，均參照文獻(xiàn)[8]配制；可溶性淀粉溶液(20g/L)、碘液、磷酸緩沖液(pH6.0)、鹽酸溶液(0.1mol/L)，均參照文獻(xiàn)[9]配制；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種：黑曲霉(Aspergillus niger) AS3.3928，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心(GIMCC)。

斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200g、葡糖糖20g、瓊脂18g、水1000mL，自然pH值；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：橘皮適量、麩皮2.5g、豆粕粉1.5g、 (NH4)2SO40.1g、K2HPO40.009g、ZnSO40.018g、MnSO4·7H2O 0.036g、FeSO4·7H2O 0.002g、吐溫-80 0.1mL、水適量，自然p H值。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-4802H 紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GKC21CR4可控硅恒溫水浴鍋 上海錦屏儀器儀表有限公司；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；DHG-9070B數(shù)顯電熱恒溫干燥箱、LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 工藝流程

1.4.2 孢子懸浮液制備

在斜面試管上接種黑曲霉，28℃培養(yǎng)3～5d[10]，以斜面試管長(zhǎng)滿孢子為準(zhǔn)，加入10mL無(wú)菌水洗下，用玻璃珠打散，制成孢子懸浮液。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶

在250mL錐形瓶中，裝入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，裝料量高2cm[11]，在121℃、0.1MPa滅菌30min，冷卻后接種孢子懸浮液，搖勻打散，在28℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)期間翻曲2～3次，并注意保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣濕度。

1.4.4 粗酶液制備

取5g麩曲于三角瓶中，加入50mL蒸餾水，在40℃水浴浸提1h。然后用脫脂棉過(guò)濾，濾液即為粗酶液，4℃保存，24h內(nèi)使用[12]。

1.4.5 酶活力測(cè)定

纖維素酶活力測(cè)定：采用文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)的濾紙法測(cè)定。纖維素酶活力定義：在37℃、pH5.5、反應(yīng)60min的條件下，每分鐘降解濾紙釋放1μmol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。以每克麩曲所含的酶活力單位(U/g)表示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照文獻(xiàn)[7]并稍作修改，以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液含糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得擬合的線性回歸方程為y＝0.2628x＋0.0047(R2＝0.9980)，擬和度較高，曲線線性良好，可信度較高。

淀粉酶活力測(cè)定：采用文獻(xiàn)[8]的方法測(cè)定。淀粉酶活力定義：1mL酶液，在60℃、pH6.0條件下，1h液化1g可溶性淀粉定義為1個(gè)酶活力單位。以每克麩曲所含的酶活力單位(U/g)表示。

1.4.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取橘皮含量、接種量、培養(yǎng)基含水量及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵各因素對(duì)發(fā)酵橘皮產(chǎn)酶的影響

2.1.1 橘皮含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別稱取10、12、14、16、18、20g剪碎的橘皮，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別在培養(yǎng)基中加入4mL無(wú)菌水、接入15%的孢子液，28℃條件下培養(yǎng)60h，產(chǎn)酶結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基橘皮含量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of orange peel content on the production of cellulase and amylase

由圖1可知，隨著培養(yǎng)基中橘皮含量的增加，纖維素酶和淀粉酶活力均逐漸增大，尤其纖維素酶的活力較高。當(dāng)橘皮含量為16g時(shí)，纖維素酶和淀粉酶活力均達(dá)到最大值，此后隨著橘皮含量的增加，兩種酶活力均不斷降低。分析原因可能是，橘皮中含有碳水化合物、多種維生素及礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分供菌種利用產(chǎn)酶，而其中含量較高的纖維素還對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，使纖維素酶大量生成，但添加橘皮過(guò)多時(shí)，培養(yǎng)基黏度增大，透氣性變得較差，影響了產(chǎn)酶效果。

2.1.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別在含16g橘皮的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入5%、10%、15%、20%、25%的孢子液，各培養(yǎng)基分別加入4mL無(wú)菌水，28℃條件下培養(yǎng)60h，產(chǎn)酶結(jié)果見(jiàn)圖2。開(kāi)始時(shí)纖維素酶和淀粉酶的產(chǎn)量均隨孢子液接種量的增加而增大，且在一定接種量時(shí)達(dá)到最大值，此后兩種酶的產(chǎn)量均隨接種量的增加而減少。分析原因可能是，接種量過(guò)小時(shí)，菌體生長(zhǎng)較弱，影響酶活力，且接種量小往往使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，不利于生產(chǎn)；接種量太大時(shí)，菌體生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)主要被菌體用于自身的生長(zhǎng)，且培養(yǎng)液黏度增加，造成溶氧不足，另外菌體大量生長(zhǎng)產(chǎn)熱多，使曲內(nèi)溫度升高，后期菌絲營(yíng)養(yǎng)不足，從而影響菌絲的生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)生[13]。圖2顯示，接種量為15%時(shí)，纖維素酶活力最大；當(dāng)接種量為10%時(shí)，淀粉酶活力最大，但與接種量15%時(shí)的淀粉酶活力相差很小。綜合考慮，選擇接種量15%作為最佳接種條件。

圖2 孢子液接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of inoculum size on the production of cellulase and amylase

2.1.3 培養(yǎng)基初始含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別在含16g橘皮、接種量15%的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水1、3、4、6、8mL，相應(yīng)的培養(yǎng)基初始含水量分別為57.0、60.0、62.5、65.0、68.0mL/100g，28℃條件下培養(yǎng)60h，產(chǎn)酶結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 培養(yǎng)基初始含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of water content in solid medium on the production of cellulase and amylase

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始含水量為65mL/100g時(shí)，纖維素酶活水平最高，而淀粉酶在含水量為62.5mL/100g時(shí)酶活性最高。培養(yǎng)基含水量過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基黏度增加，易結(jié)塊，透氣性差，氧氣輸送量減少[14-15]，影響產(chǎn)酶，兩種酶的活力都迅速下降到最低值。綜合考慮，培養(yǎng)基含水量為62.5～65.0mL/100g，即加水量為4～6mL時(shí)，兩種酶的活力均較高。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基加入橘皮16g、無(wú)菌水4mL、接種量15%，28℃條件下分別發(fā)酵36、48、60、72、84h，兩種酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the production of cellulase and amylase

由圖4可知，發(fā)酵36h時(shí)，菌體生長(zhǎng)處于延遲期，培養(yǎng)基表面有少量白色菌絲形成，此時(shí)有少量纖維素酶和淀粉酶生成；發(fā)酵48h時(shí)，白色菌絲長(zhǎng)滿，培養(yǎng)基結(jié)塊，有零星黑色孢子長(zhǎng)出，此時(shí)纖維素酶開(kāi)始大量合成，而淀粉酶活力達(dá)到最大值；發(fā)酵60h時(shí)，孢子長(zhǎng)得較快，纖維素酶活力繼續(xù)上升，而淀粉酶活力則明顯降低；發(fā)酵72h時(shí)，白色菌絲表面長(zhǎng)滿黑色孢子，遍及培養(yǎng)基表面，但此階段纖維素酶生成速度趨緩，酶活基本達(dá)到高峰，而淀粉酶活力持續(xù)下降；發(fā)酵84h時(shí)，是菌體生長(zhǎng)的減速期，培養(yǎng)基內(nèi)外長(zhǎng)滿黑色孢子，孢子趨向成熟，此階段纖維素酶繼續(xù)有少量生成，酶活達(dá)最大值，淀粉酶活力則下降到最低值。雖然發(fā)酵72h后纖維素酶活力較高，但考慮到72～84h時(shí)，有大量孢子產(chǎn)生，不利于產(chǎn)品性狀，因?yàn)辂熐泻咦恿康亩嗌僦苯佑绊懞罄m(xù)工藝中酶的提取、純化等處理，進(jìn)而影響到酶的質(zhì)量[16-17]，而發(fā)酵60h時(shí)，淀粉酶活力不但比發(fā)酵72h時(shí)高很多，而且纖維素酶活力同發(fā)酵72h相差不大，時(shí)間卻可以節(jié)省很多，綜合考慮，選取最佳發(fā)酵時(shí)間為60h。

2.2 最優(yōu)產(chǎn)酶條件的確定

由表1的極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶的影響是不一致的。影響纖維素酶活力的因素主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B，發(fā)酵時(shí)間為主要影響因素，最佳產(chǎn)酶條件為A1B2C2D2；影響淀粉酶活力的因素主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B，培養(yǎng)基含水量為主要影響因素，最優(yōu)產(chǎn)酶條件為A3B2C2D2。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 1 Results of orthogonal tests and range analysis

由于因素A是影響纖維素酶活力的較主要因素，卻是影響淀粉酶活力的次要因素，因此應(yīng)優(yōu)先考慮因素A對(duì)纖維素酶活力的影響，對(duì)于因素A的水平可選擇A1，這不僅與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符，而且節(jié)約了原料，降低了生產(chǎn)成本。最終確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件為A1B2C2D2，即在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加16g橘皮，并加入5mL無(wú)菌水使得培養(yǎng)基初始含水量為64mL/100g，黑曲霉接種量15%，發(fā)酵60h。該條件下所得纖維素酶和淀粉酶的活力均達(dá)到最大值，分別為1816U/g和196U/g。

3 結(jié) 論

富含果膠、纖維素及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的柑橘皮是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的良好原料，不僅可以生產(chǎn)出某些活力較高的酶制劑，而且使柑橘皮這一廢棄資源得到了充分利用，因而具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加16g橘皮，并加入5mL無(wú)菌水使培養(yǎng)基初始含水量為64mL/100g，黑曲霉接種量15%、發(fā)酵60h。在此發(fā)酵條件下所產(chǎn)纖維素酶活力可達(dá)1816U/g，淀粉酶活力達(dá)196U/g。表明利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵橘皮，非常有利于纖維素酶的生產(chǎn)，所得酶活力較高，但淀粉酶產(chǎn)量較低，這可能是因?yàn)殚倨ぶ泻控S富的纖維素對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用。因而利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵橘皮產(chǎn)纖維素酶是一種很有應(yīng)用前景的纖維素酶制備方法。

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Solid State Fermentation (SSF) of Orange Peels for Production of Cellulase and Amylase byAspergillus niger

ZHANG Shuai，CHEN Yi，DONG Ji，LIANG Qiao-rong
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Zhaoqing University, Zhaoqing 526061, China)

Orange peels were fermented byAspergillus nigerto produce cellulase and amylase by solid state fermentation (SSF).The effects of orange peel and water contents in SSF medium, inoculum size and fermentation time on cellulose and amylase activities were explored by one-factor-at-a-time method. Based on the results obtained, the fermentation conditions for the production of cellulase and amylase were optimized by orthogonal array design to be orange peel content of 16 g, initial water content of 64 mL/100 g, inoculum size of 15% and fermentation time of 60 h. Under these fermentation conditions, the activities of cellulase and amylase were 1816 U/g and 196 U/g, respectively. This study suggests that solid state fermentation can provide a promising strategy for the production of cellulase and amylase from orange peels byAspergillus niger.

orange peels；Aspergillus niger；solid state fermentation (SSF)；cellulase；amylase

TQ920.1

A

1002-6630(2012)11-0190-04

2011-05-16

張帥(1978—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。E-mail：Chinazhsh@gmail.com