鮐魚中產(chǎn)組胺菌的分離篩選與生物學(xué)特性初步研究

楊 健，吳祖芳，*，周秀錦，翁佩芳，李微微

（1.應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波315211；2.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316100）

鮐魚中產(chǎn)組胺菌的分離篩選與生物學(xué)特性初步研究

楊 健1，吳祖芳1，*，周秀錦2，翁佩芳1，李微微1

（1.應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波315211；2.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316100）

利用產(chǎn)組胺菌鑒別培養(yǎng)基，對鮐魚內(nèi)臟中產(chǎn)組胺菌進行初步篩選，結(jié)合高效液相色譜分析方法對分離菌株的產(chǎn)組胺能力進行了確認；并通過菌株的生理生化、形態(tài)和16S rDNA基因序列分析對分離得到的菌株進行鑒定；研究了溫度和pH對菌株生長和產(chǎn)組胺的影響。結(jié)果表明，從鮐魚中初步分離的4株菌（T4、T5、T6和T9）在組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生164.1～466.1μg/100mL組胺；經(jīng)生理生化特性及16S rDNA序列測定為相同菌種，對其中T4菌株進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)菌株T4與產(chǎn)粘液變形桿菌相似性最高。T4菌株生長和產(chǎn)組胺的最適溫度均為20℃，最適pH均為7。

鮐魚，產(chǎn)組胺菌，生理生化特性，16S rDNA序列分析

鮐魚（Pneumatophorus japonicus），鱸形目，鯖科，鮐屬，屬中上層魚類，分布廣泛，是我國重要的經(jīng)濟魚類之一；其體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸含量很高，尤其是組氨酸，而組氨酸極易被一些酶類（組氨酸脫羧酶）分解而產(chǎn)生組胺（超過一定含量能夠使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)），因此由于食用含有高含量組胺的魚類而產(chǎn)生的中毒事件常有報道[1-3]，組胺也是出口水產(chǎn)食品重要的控制指標之一。關(guān)于組胺的產(chǎn)生機制目前存在兩種觀點，一是由于中上層魚體內(nèi)含有豐富的組氨酸，在貯藏或加工過程中，合適的條件會令魚體內(nèi)酶系打破之前的平衡狀態(tài)，發(fā)生自溶現(xiàn)象而產(chǎn)生組胺；另一觀點是體內(nèi)的組氨酸在微生物作用下發(fā)生分解而產(chǎn)生組胺。據(jù)文獻報道，大部分的產(chǎn)組胺菌屬腸道菌如腸桿菌科等[4-6]。本研究利用鑒別培養(yǎng)基并結(jié)合高效液相色譜法，對由鮐魚內(nèi)臟分離出的產(chǎn)組胺菌進行形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析和菌種鑒定，并研究了溫度和pH環(huán)境因素對菌株生長和產(chǎn)組胺能力的影響，研究結(jié)果可為控制冷凍水產(chǎn)品中組胺含量提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮鮐魚 2011年4月16日購自于浙江省寧波市江北區(qū)莊市菜市場，無菌袋包裝、冰袋冷藏，于0.5h內(nèi)運到實驗室，-18℃保藏，以備實驗用；組胺標準品

Sigma公司；丹磺酰氯 ACROS公司；L-組氨酸、1，7-二氨基庚烷 阿拉丁試劑公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；DNA聚合酶、質(zhì)粒載體pMD18-T vector 大連寶生物公司；乙腈、甲醇 迪馬公司；色譜分析試劑 色譜純；其它試劑均為化學(xué)純或分析純；初步篩選培養(yǎng)基（產(chǎn)組胺菌鑒別培養(yǎng)基） 胰蛋白胨5g、酵母膏5g、L-組氨酸2g、NaCl 5g、瓊脂15g、甲酚紅0.2g、蒸餾水1000m L加熱溶化，調(diào)pH至6.5；組胺發(fā)酵培養(yǎng)基 L-組氨酸10g、大豆蛋白胨17g、NaCl 3.0g、磷酸氫二鉀2.5g、丙酮酸鈉10.0g、葡萄糖2.5g、蒸餾水1000m L，調(diào)pH至7.0，分裝試管；運動性檢測培養(yǎng)基和產(chǎn)酸產(chǎn)氣檢測培養(yǎng)基 參照陶志華等人的運動型檢測和糖分解實驗所用培養(yǎng)基[7]，以上培養(yǎng)基于1.01×105Pa高壓下，121℃蒸汽滅菌15m in。

XSP-2CA型普通光學(xué)顯微鏡 上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司；LRH-190-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；LDZX-40BI型立式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；LC1200型液相色譜儀 美國安捷倫公司；Mastercycler pro型梯度PCR儀 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組胺含量的測定 發(fā)酵液預(yù)處理：取各菌株發(fā)酵液及空白對照1m L于5m L離心管，同時分別取10mg/L組胺標準使用液（用0.1mol/L鹽酸配制而成）0、50、100、200、500μL（濃度10μg/m L）于5m L離心管中，依次加入100μL 2mol/L氫氧化鈉（標準品不加）、20μL 100mg/L 1，7-二氨基庚烷（內(nèi)標物，用0.1mol/L鹽酸配制而成）標準使用液、300μL飽和碳酸氫鈉、2m L丹酰氯衍生劑溶液（用色譜級丙酮配制成濃度為10mg/m L）進行衍生，振蕩混勻后于60℃烘箱內(nèi)放置45m in，再加入100μL氨水放置40m in，最后用乙腈定容至5m L，振蕩混勻，取1m L經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件：流動相A：0.01mol/L乙酸銨，流動相B：乙腈與0.01mol/L乙酸銨9∶1混合；流動相A∶流動相B=2∶8，流速1.0m L/m in，紫外檢測器波長254nm，進樣量20μL。

1.2.2 菌懸液的制備 將初步分離菌種的斜面保藏菌種連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。取一定量新鮮菌液離心棄上清，用組胺發(fā)酵培養(yǎng)基將菌體調(diào)至105cfu/m L，備用。

1.2.3 產(chǎn)組胺菌的初步篩選 將冷凍（-18℃以下）鮐魚的內(nèi)臟取出后，用無菌剪刀剪碎，稱取10.0g置于裝有90.0m L無菌生理鹽水的三角瓶中，混勻。用無菌生理鹽水將其依次稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6后，取0.1m L稀釋液涂布到初步篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h，菌落周圍出現(xiàn)紫色暈環(huán)的為可能產(chǎn)組胺的菌株，再在初篩培養(yǎng)基上純化兩次以上，取單菌落保存菌種。

1.2.4 待測菌株產(chǎn)組胺能力確認 取1m L初步分離菌株菌懸液接種于9m L組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中（此時菌液濃度約為104cfu/m L），并設(shè)置空白對照組（不接種菌株），30℃下靜置恒溫培養(yǎng)48h，檢測發(fā)酵液是否有組胺產(chǎn)生。

1.2.5 產(chǎn)組胺菌株16S rDNA的PCR擴增與序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以分離菌菌懸液為模板，選用細菌16S rDNA通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’擴增產(chǎn)組胺菌株16S rDNA全長。25μL反應(yīng)體系：15μL H2O、2.5μL Buffer10×、1.5μLMgCl2、4μL 2.5mM dNTP、0.5μL 10μM引物27F、0.5μL 10μM引物1492R、0.2μL 5U/μL Ex Taq聚合酶、1μL菌液為模板；PCR程序：95℃預(yù)變性8min、94℃變性50s、54℃復(fù)性50s、72℃延伸90s，總計30個循環(huán)，最后在72℃延伸10m in；PCR反應(yīng)物用1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測；預(yù)期大小的擴增條帶用Genden瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，連接入pMD18-T Vector質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α，涂布在添加有氨芐的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，選取長勢較好的菌落，挑取菌種并接種到LB培養(yǎng)基中，再次37℃過夜培養(yǎng)，利用PCR檢測基因是否轉(zhuǎn)錄成功，若成功，從剩下菌落挑取細菌接種至LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，菌液送上海英濰捷基公司測序；所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，進行序列比對，最后選取數(shù)株同源性較高的細菌，利用MEGA 4.1軟件建立產(chǎn)組胺菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 溫度對產(chǎn)組胺微生物生長和產(chǎn)組胺的影響 取1m L產(chǎn)組胺菌株的菌懸液接種至9m L組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中，分成五組分別于4、20、25、30、35℃下靜置培養(yǎng)24h，每個溫度均設(shè)置空白對照；取1m L稀釋到平板，測定細菌總數(shù)；另取1m L通過高效液相色譜法測定組胺含量。

1.2.7 pH對產(chǎn)組胺菌株生長和產(chǎn)組胺的影響 取1m L菌懸液接種于9m L pH分別為4、5、6、7、8的組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中（每個pH均設(shè)置空白對照），30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h；采用1.2.5中的方法測定發(fā)酵液中的細菌總數(shù)和組胺含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中產(chǎn)組胺含量的測定

取0、50、100、200、500μL的10μg/m L組胺標準溶液分別加入1m L發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)1.2.1衍生處理后，通過高效液相色譜法測定，利用A09.03【1417】積分模塊處理數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 組胺檢測的HPLC色譜圖Fig.1 Chromatogram of histamine detected by HPLC

從圖1中的A和B可以看出，組胺和1，7-二氨基庚烷均能夠很好的從發(fā)酵液中分離出來，組胺峰出現(xiàn)在11.7min左右，1，7-二氨基庚烷峰出現(xiàn)在14.9min左右，并且能準確測定組胺的含量。其中，圖1B是T5菌株發(fā)酵液檢測到組胺存在的HPLC色譜圖，這表明T5菌株能夠產(chǎn)生組胺。由于菌株T4、T6和T9發(fā)酵液HPLC色譜圖中除組胺峰強大小與T5有較大區(qū)別外，其它沒有明顯不同，因此不再列出色譜圖。另外，以空白發(fā)酵培養(yǎng)基為基底，進行三個水平回收率實驗，每個水平進行3個平行實驗，回收率見表1。

圖2 組胺標準曲線Fig.2 Standard curve of histamine

表1 組胺回收率實驗結(jié)果Table 1 Test results of histamine recovery

從圖2和表1可看出，本方法組胺標準曲線回歸系數(shù)為0.9976，且平均回收率在99.03%，因此，能滿足菌株發(fā)酵液中組胺含量的檢測需要。

2.2 產(chǎn)組胺菌株的初步篩選與產(chǎn)組胺能力的測定

從鮐魚內(nèi)臟中初步篩選得到的菌株再次接種于產(chǎn)組胺菌鑒別培養(yǎng)基（產(chǎn)組胺菌株能使培養(yǎng)基變紫色）上分純，均能使培基變成紫色。進一步通過篩選培養(yǎng)基，將分離篩選得到的10株菌（分別記為T1-T10），利用高效液相色譜檢測發(fā)酵培養(yǎng)液中組胺，結(jié)果如表2。

表2 10株菌產(chǎn)組胺能力確認Table 2 Identification of the ability to produce histamine of ten bacteria

從表2可知，從內(nèi)臟中初步分離得到的10株菌中，只有4株菌（T4、T5、T6和T9）能產(chǎn)組胺，經(jīng)高效液相色譜檢測，其產(chǎn)生組胺量范圍在164.1～466.1μg/100m L，其余均不能產(chǎn)生。

2.3 產(chǎn)組胺微生物的生理生化鑒定

對產(chǎn)組胺菌株進行生化特性鑒定，共檢測10項指標，實驗結(jié)果如表3。

根據(jù)表3中各株菌的生理生化特征，并結(jié)合個體形態(tài)和群體形態(tài)特征，參照沈萍《微生物學(xué)實驗》（第三版）和《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第九版），這4株細菌的初步鑒定結(jié)果均可能屬變形桿菌屬[8-9]。據(jù)報道Torres等人直接從智利鯖魚中分離到摩根氏菌（Morganellamorganii），并研究了其產(chǎn)組胺條件[10]。變形桿菌屬不僅存在于鯖魚中，在其它魚中也有發(fā)現(xiàn)，Rodtong等人發(fā)現(xiàn)將印度鳳尾魚放置于35℃下能迅速積累組胺，并從中分離到摩根氏菌（Morganella morganii），變形桿菌（Proteus vulgaris）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）三種主要的組胺微生物，在液體培養(yǎng)基中能產(chǎn)生104.1～203.0mg/100m L組胺[11]。本實驗分離得到的產(chǎn)組胺菌株還需進一步通過分子鑒定來確認。

2.4 產(chǎn)組胺微生物的16S rDNA基因序列分析

4株產(chǎn)組胺菌株的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物為1條大小約1500bp的特異性條帶；將序列在NCBI上進行16S rDNA序列同源性比較，分析了相關(guān)序列的同源性，結(jié)果進一步證明分離得到的產(chǎn)生組胺的菌株屬于同一種菌，選擇產(chǎn)組胺相對較多的菌株T4，構(gòu)建了分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

圖3 16S rDNA基因序列分類聚類結(jié)果Fig.3 Themolecular phylogenetic tree of strain T4 based on 16S rDNA sequences

從圖3上16S rDNA基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，T4與產(chǎn)粘液變形菌（Proteusmyxofaciens）聚成一支，具有最高的序列相似性，這表明T4與產(chǎn)粘液變形菌的親緣關(guān)系最近。

2.5 溫度對T4菌株生長和產(chǎn)組胺的影響

將產(chǎn)組胺菌株菌懸液接種至組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中（此時菌濃度約為104cfu/m L），分成5組（每組至少3個平行）在4、20、25、30、35℃條件下靜置培養(yǎng)24h（每個溫度均設(shè)置空白對照），測定培養(yǎng)液中細菌總數(shù)和組胺含量，結(jié)果見圖4。

從圖4A可知，在20℃下，細菌總數(shù)達到最大，有最大生物量11.75logCFU/m L，在20～30℃溫度范圍內(nèi)，T4菌的生長速度隨著溫度升高而稍有下降。4℃下，細菌總數(shù)較初始值幾乎沒有變化，表明4℃冷藏溫度能夠抑制該菌生長。

表3 4株產(chǎn)組胺菌生理生化特性鑒定Table 3 Identification of physiological and biochemical characteristics of four histamine-forming bacteria

從圖4B可以看出，4℃下，該菌株不能產(chǎn)生組胺，表明該溫度不僅能夠抑制該菌生長，而且能夠抑制其產(chǎn)生組胺。但在20℃時，有最大的組胺產(chǎn)生量491.1μg/100m L。之后，隨溫度上升而下降，表明溫度高于20℃，對該菌產(chǎn)生組胺是不利的。對比圖4A和圖4B，可以發(fā)現(xiàn)，該菌的生長最適溫度與產(chǎn)組胺最適溫度相同。

圖4 溫度對T4菌株生長和產(chǎn)組胺的影響Fig.4 Effectof the temperature on growth and histamine production of strain T4

2.6 pH對T4菌株生長和產(chǎn)組胺的影響

將組胺發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4、5、6、7和8，然后取1m L J2和J4菌懸液接種于裝有9m L培養(yǎng)基的試管中，30℃靜置培養(yǎng)24h（每個pH均設(shè)置空白對照），測定培養(yǎng)液中細菌總數(shù)和組胺含量，結(jié)果見圖5A和圖5B。

圖5 pH對菌株T4生長和產(chǎn)組胺的影響Fig.5 Effectof the pH on growth and histamine production of strain T4

從圖5A可以看出，T4菌株的生長最適pH為7，此時有最大生物量11.32logCFU/m L，pH低于或高于7都將會使其生長速度減慢。從圖5B中可知，T4菌產(chǎn)組胺的最適pH也為7，此時有最大生物量465.3μg/100m L，降低或升高pH也會使生物量減少。綜合圖5A和圖5B，同樣可以看出，T4菌的生長最適pH和產(chǎn)組胺最適pH相同。

3 結(jié)論

利用產(chǎn)組胺鑒別培養(yǎng)基，從鮐魚中初步篩選出的菌株中有4種菌在組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生組胺，在組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生組胺的量為164.1～466.1μg/100m L；經(jīng)生理生化實驗和16S rDNA初步判定為變形桿菌，屬細菌，其中菌株T4與產(chǎn)粘液變形桿菌（Proteus myxofaciens）相似性最高，其最適生長溫度為20℃，最適pH為7，此條件下分別有最大生物量11.75logCFU/m L和11.32logCFU/m L；最適產(chǎn)組胺溫度為20℃，最適pH為7，分別有最大生物量491.1mg/100m L和465.3mg/100m L。本研究結(jié)果可為鮐魚食品深加工及質(zhì)量安全控制方法提供重要依據(jù)，也為研究鮐魚等魚類的加工新工藝奠定了基礎(chǔ)。

[1]蔡利民.一起組胺食物中毒調(diào)查[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，19（1）：50.

[2]Chang SC，Kung H F，Chen H C，et al.Determination of histamine and bacterial isolation in swordfish fillets（Xiphias gladius）implicated in a food borne poisoning[J].Food Control，2008（19）：16－21.

[3]Tsai Y H，Hsien H S，Chen H C，et al.Histamine level and species identification of billfish meats implicated in two foodborne poisonings[J].Food Chemistry，2007，104（4）：1366－1371.

[4]TsaiY H，Lina CY，Chang SC，etal.Occurrence ofhistamine and histamine－forming bacteria in salted mackerel in Taiwan[J]. Food Microbiology，2005，22（5）：461－467.

[5]Huang Y，Liu K，Hsieh H，etal.Histamine leveland histamineforming bacteria in dried fish products sold in Penghu Island of Taiwan[J].Food Control，2010（21）：1234－1239.

[6]Hsu H，Chuang T，Lin H，et al.Histamine content and histamine－forming bacteria in dried milkfish（Chanos chanos）products[J].Food Chemistry，2009，114（3）：933－938.

[7]陶志華，佐藤實.金槍魚肉中高組胺菌的分離及理化性質(zhì)分析[J].生物技術(shù)，2009，19（5）：41－43.

[8]沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2001：116－123.

[9]Elliot J M，Mathre D E，Sand D C.Identification and characterization of rhizosphere－competent bacteria of wheat[J]. Applied and Environmental Microbiology，1987，53（12）：2793－2799.

[10]Torres S，Roeckel M，Cristina MartíM.Histamine formation by Morganella morganii isolated from trachurus murphyii（Chilean mackerel）[J].Latin American Applied Research，2002，32（2）：209－214.

[11]Rodtong S，Nawong S，Yongsawatdigul J.Histamine accumulation and histamine－forming bacteria in Indian anchovy（Stolephorusindicus）[J].Food Microbiology，2005，22（5）：475－482.

Study on isolation and biological characteristics of histam ine-producing bacteria from mackerel

YANG Jian1，WU Zu-fang1，*，ZHOU Xiu-jin2，WENG Pei-fang1，LIW ei-wei1
（1.Faculty of Life Science and Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316100，China）

Histam ine-form ing bacteria were isolated by p resc reening step using the identification med ium from viscera ofmackerel，and the ability to p roduce histam ine of true histam ine formers were confirmed by HPLC analysis method.The strains were identified by physiology and biochem istry indicators，morphology and 16S rDNA gene sequence analysis.The results showed that the four histam ine-p roducing bac teria（T4，T5，T6 and T9）isolated from mackerel could p roduce 164.1～466.1μg/100m L histam ine in tryp ticase soya broth supp lemented w ith 1.0%L-histid ine.These strains were found identity by mean of physiochem ical p roperties and 16S rDNA gene sequence analysis among them.The T4 strain further conducted by phylogenetic analysis was found the highest sim ilarity w ith Proteus myxofaciens.The op timalgrow ing tem perature and pH to p roduce histam ine of strain T4 were 20℃and 7 respectively.

mackerel；histam ine-p roducing bacteria；physiological and biochem ical characteristics；16S rDNA sequence analysis

TS254.1

A

1002-0306（2012）09-0190-04

2011－08－12 *通訊聯(lián)系人

楊?。?987-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究項目（2010C33180）。