海紅果多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

郝志鵬，馬麗杰，吳 敬*，王英麗，包海泉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

海紅果多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

郝志鵬1,2，馬麗杰2，吳 敬1,*，王英麗1，包海泉1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

目的：探討海紅果多糖(polysaccharide fromMalus prunifoliaBorkh，PFM)提取工藝條件及其體外抗氧化活性。方法：采用三因素三水平正交試驗設計，考察提取溫度、時間和料液比3個因素對海紅果多糖提取工藝的影響；以VC為對照，應用DPPH法測定海紅果多糖清除有機自由基能力、ABTS法測定其總抗氧化能力、Fenton反應測定其清除羥自由基能力。結果：PFM最佳提取工藝條件為提取溫度90℃、提取時間6h、料液比1:10(g/mL)，此條件下PFM得率為6.75%；PFM對羥自由基具有較強的清除作用(P＜0.05)，效果優(yōu)于清除DPPH自由基和ABTS+自由基，但弱于VC。結論：優(yōu)化海紅果提取工藝得到的PFM具有較強的體外抗氧化活性。

海紅果；多糖；提?。惑w外抗氧化

海紅果是薔薇科蘋果屬楸子(Malus prunifolia(wild) Borkh)的果實，又名海紅、海棠果[1-3]，在我國主要分布在晉、陜、蒙三省(區(qū))交界處，如山西保德、河曲、偏關，陜西府谷、內(nèi)蒙古準格爾旗等，在呼和浩特市的清水河縣有種植基地。海紅果營養(yǎng)豐富，經(jīng)常食用可健胃消食、增強食欲，軟化血管。某些地區(qū)以海紅果代替山楂入藥，具有醒腦提神、去膩除腥的功效[4-5]。

關于海紅果的報道目前以海紅果提取黃酮類為主[6-8]，有關海紅果多糖(polysaccharide fromMalusprunifoliaBorkh，PFM)的體外抗氧化作用國內(nèi)未見報道。本實驗采用3種體外抗氧化作用評價方法對PFM進行檢測，以抗壞血酸VC作為陽性對照，共同評價海紅果多糖體外抗氧化作用[9]，為今后海紅果深加工及其相關領域的深入研究或開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

海紅果購于內(nèi)蒙古呼和浩特市清水河縣，新鮮優(yōu)質(zhì)海紅果清洗，去掉果核，果肉切片，6 0℃烘干，粉碎，過6 0目篩備用。

1,1-二苯基-2-三硝苯肼(DPPH)、ABTS、過硫酸鉀 美國Sigma公司；羥自由基試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他化學試劑均為分析純。

T6-新銳可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；DHG-9075A型真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有公司醫(yī)療設備廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；AL204型臺式電子分析天平；TG-16-WS型臺式高速離心機；HY-08高速粉碎機。

1.2 方法

1.2.1 水提醇沉法提取海紅果多糖

取10g樣品粉末按料液比1:30置于250mL圓底燒瓶中，水浴提取(6h、90℃)，過濾合并濾液，濃縮至原體積1/4加入5倍體積95%乙醇醇沉24h，離心(8000r/min、15min)，分別用無水乙醇、丙酮沖洗2～3次，得海紅果粗多糖，粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白(氯仿:正丁醇＝1:5，V/V)比例混合，劇烈振搖20min，離心10min(8000r/min)，棄去下層有機相和蛋白沉淀層，取上層多糖水溶液再次用相同的方法重復操作一次，得到去蛋白的多糖溶液，后用80%乙醇沉淀、洗滌離心后干燥得PFM，備用。

1.2.2 PFM提取的單因素試驗

1.2.2.1 提取料液比的選擇

稱取5份海紅果粉末各1g，在時間6h、提取溫度90℃條件下，分別以1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)的料液比進行試驗，考察料液比對產(chǎn)品中PFM得率的影響。

1.2.2.2 提取時間選擇

稱取5份海紅果粉末各1g，料液比1:30，提取溫度90℃的條件下，分別以2、3、4、5、6h進行試驗，考察提取時間對產(chǎn)品中PFM得率的影響。

1.2.2.3 提取溫度的選擇

稱取5份海紅果粉末各1g，料液比1:30、提取時間6h條件下，分別以50、60、70、80、90℃五個溫度進行試驗考察提取溫度對產(chǎn)品中PFM得率的影響。

1.2.3 海紅果多糖提取工藝正交試驗

根據(jù)海紅果性質(zhì)和生產(chǎn)要求，擬定影響海紅果浸出效果的3個因素即為料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為優(yōu)選因素，每個因素3個水平進行L9(34)正交試驗，因素水平見表1。

表1 海紅果多糖提取工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels for orthogonal array design

1.2.4 PFM得率的測定

應用苯酚硫酸法測定PFM含量[10]。

1.2.4.1 葡萄糖標準溶液的配制

精確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的標準葡萄糖0.1000g，置于100mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，葡萄糖質(zhì)量濃度1.0mg/mL，在使用前稀釋成葡萄糖質(zhì)量濃度0.1mg/mL。

1.2.4.2 5%苯酚液的制備

取苯酚200g，加鋁片0.2g、碳酸氫鈉0.1g，蒸餾收集182℃餾分，稱取此餾分12.5g，加蒸餾水250mL，置棕色瓶中備用。

1.2.4.3 標準曲線的制備

精確量取葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置具塞試管中。各加蒸餾水加至1mL，在分別加入5%的苯酚液0.6mL，濃硫酸3.6mL，振蕩混勻，沸水加熱30min，取出后迅速冷卻至室溫，用可見分光光度法在490nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線的回歸方程：y＝0.0855x＋0.0973，R2＝0.9982。結果表明，在1～5mg/mL范圍內(nèi)吸光度與質(zhì)量濃度線性關系良好。

1.2.4.4 海紅果多糖得率的測定

用蒸餾水溶解海紅果粉末樣品20mg，按照優(yōu)化工藝處理得PFM定容至100mL，精密吸取溶液3份，每份1mL，加水至2mL，再加入0.6mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸3.6mL搖勻，沸水加熱30min，取出后迅速冷卻至室溫，另取2mL蒸餾水做對照，然后在波長490nm處測定吸光度，按下式計算樣品溶液中多糖得率。

式中：C為供試溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；D為供試溶液的稀釋倍數(shù)；F為換算因子取值為0.9；m為海紅果粉末樣品質(zhì)量/mg。

1.2.5 PFM體外抗氧化活性實驗

1.2.5.1 PFM和VC溶液的配制

精確稱取PFM，用適量蒸餾水充分溶解，制成質(zhì)量濃度1.0mg/mL的母液A，取母液A稀釋，質(zhì)量濃度分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

精確稱取VC溶液，用適量蒸餾水充分溶解，制成質(zhì)量濃度1.0mg/mL的母液B，取母液B稀釋，質(zhì)量濃度分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

1.2.5.2 PFM體外抗氧化活性測定

依據(jù)試劑盒及文獻方法，對各溶液分別應用DPPH法測定總抗氧化能力[11]，ABTS法測定海紅果多糖總抗氧化能力[12-13]，F(xiàn)enton反應測定對羥自由基清除能力。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 海紅果粗多糖提取條件的單因素試驗

2.1.1 料液比對多糖得率的影響

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，在料液比1:10～1:30范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，溶質(zhì)的擴散動力增加，多糖提取率明顯上升，因此提取以料液比1:30為宜。

2.1.2 提取時間對多糖提取的影響

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，提取時間為6h，多糖提取量較多，因此，提取時間以6 h為宜。

2.1.3 提取溫度對多糖提取的影響

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，溫度是影響多糖提取的關鍵因素之一，在溫度為50～90℃的范圍內(nèi)，海紅果多糖含量隨溫度的升高而增加。因此將溫度確定為90℃。

2.2 海紅果多糖提取工藝正交試驗

參照單因素試驗結果，以影響海紅果多糖得率的料液比、提取溫度、提取時間3因素進行正交試驗，試驗設計及結果見表2。

表2 海紅果多糖L9(34)提取工藝優(yōu)化正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design scheme and corresponding results

由表2可見，影響海紅果多糖得率的3個因素主次順序為RB＞RA＞RC，最優(yōu)組合為A1B3C3，即PFM提取工藝確定為提取時間6h、提取溫度90℃、料液比1:10(g/mL)，此條件下多糖得率為6.75%。

2.3 PFM總抗氧化能力測定

2.3.1 PFM清除游離DPPH自由基的能力

DPPH法常用于測定生物試樣和食品的抗氧化能力。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其溶液具有獨特的紫紅色特征吸收峰，并在波長517nm測定其吸光度。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對使其褪色，褪色程度與接受的電子數(shù)量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析。

表3 DPPH法測定海紅果多糖與VC對自由基清除的結果Table 3 Comparison of the scavenging effects of PMM and vitamin C on DPPH free radicals

由表3可見，質(zhì)量濃度為0.8、0.6mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.01)；質(zhì)量濃度0.4mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.05)；質(zhì)量濃度在1、0.2mg/mL時，PFM與VC之間清除率無顯著差異。

2.3.2 PFM清除ABTS+自由基的能力

ABTS經(jīng)活性氧化后生成ABTS+自由基，是一種穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基，加入樣品后，被測物質(zhì)存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+發(fā)生反應使體系逐漸褪色，抗氧化能力越強其供電子能力越強，反應自由基能力越大，反應速率也越快，因此可以通過測定吸光度值直接反應樣品還原能力的大小[14]。

表4 ABTS法測定PFM與VC對自由基清除的結果Table 4 Comparison of the scavenging effects of PMM and vitamin C on ABTS free radicals

由表4可見，質(zhì)量濃度1mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.01)；質(zhì)量濃度0.8mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.05)；質(zhì)量濃度在0.6、0.4、0.2mg/mL時，PFM與VC之間清除率無顯著差異。

2.3.3 PFM清除羥自由基的能力

羥自由基是國際學者們公認的毒性最強的活性氧自由基，是生物有機體過氧化損傷的主要因素[15]。由表5可見，質(zhì)量濃度1、0.6mg/mL時，PMM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.01)；質(zhì)量濃度0.8、0.4、0.2mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.05)。

表5 PFM與VC對羥自由基清除的結果Table 5 Comparison of the scavenging effects of PMM and vitamin C on hydroxyl free radicals

2.3.4 海紅果多糖對3種自由基清除能力的比較

表6 PFM對3種自由基清除能力的比較Table 6 Comparison of the scavenging effects of PFM on three types of free radicals

由表6可見，質(zhì)量濃度1mg/mL時PFM對3種自由基清除能力有顯著差異(P＜0.01)；質(zhì)量濃度0.6、0.4mg/ mL時，PFM對3種自由基清除能力有顯著差異(P＜0.05)。在質(zhì)量濃度0.8、0.2mg/mL時，二者清除率差別無統(tǒng)計學差異。

3 討論與結論

3.1 通過正交試驗設計對PFM提取工藝進行優(yōu)化，最佳工藝條件為提取時間6h、提取溫度90℃、料液比1:10，多糖得率為6.75%。

3.2 以抗壞血酸(VC)為對照，采用DPPH法、ABTS法、羥自由基法測定海紅果多糖有效清除自由基的清除能力，結果表明海紅果多糖對羥自由基具有較強的清除作用(P＜0.05)，其抗氧化作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強，但抗氧化效果不及VC。DPPH自由基清除能力實驗表明，質(zhì)量濃度0.8、0.6mg/mL時，PFM與VC之間清除率有極顯著差異(P＜0.01)；質(zhì)量濃度0.4mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.05)；ABTS+自由基清除能力實驗表明，質(zhì)量濃度1mg/mL時，PFM與VC之間清除率有極顯著差異(P＜0.01)；質(zhì)量濃度0.8mg/mL時，PFM與VC之間清除率有顯著差異(P＜0.05)；抗氧化的作用可以通過多種途徑來進行評價，不同的評價系統(tǒng)其原理不相同。PFM對3種自由基的清除率在多數(shù)濃度下差異不顯著，綜合來看，清除羥自由基的效果要優(yōu)于清除ABTS+和DPPH自由基。實驗證實了PFM的體外抗氧化活性。

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Extraction andin vitroAntioxidant Activity of Polysaccharides from Dried Pulp ofMalus micromalusMakino

HAO Zhi-peng1,2，MA Li-jie2，WU Jing1,*，WANG Ying-li1，BAO Hai-quan1
(1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China；2. Teaching and Research Office of Basis Pharmacology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China)

Objective: To explore optimal extraction process andin vitroantioxidant activity of polysaccharides from dried pulp ofMalus micromalusMakino (PMM). Methods: A three-factor, three-level orthogonal array design was used to investigate the effects of three extraction conditions including temperature, time and solid-to-solvent ratio on polysaccharide yield. In order to assess thein vitroantioxidant activity of PMM using vitamin C as control, their DPPH radical scavenging activity was measured and meanwhile, their total antioxidant capacity and hydroxyl radical scavenging activity of PMM were tested by ABTS assay and Fenton reaction, respectively. Results: The optimal conditions for the extraction of polysaccharides from dried pulp ofMalus micromalusMakino were 6 h extraction at 90 ℃ and a solid-to-solvent ratio of 1:10 (g/mL), resulting in a polysaccharide yield of 6.75%. Although its antioxidant activity was weaker than that of vitamin C, PMM still revealed strong scavenging effect on hydroxyl, DPPH and ABTS+free radicals. PPM was more effective in scavenging hydroxyl free radicals than DPPH and ABTS+free radicals. Conclusion: The developed optimal procedure for the extraction of PMM is reliable. PMM has a strong antioxidant activityin vitro.

Malus micromalusMakino；polysaccharide；extraction；antioxidant activityin vitro

TQ929.2

A

1002-6630(2012)18-0088-05

2011-06-29

郝志鵬(1982—)，女，藥劑師，碩士，研究方向為中蒙藥藥理學。E-mail：117647392@163.com

*通信作者：吳敬(1969—)，女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術及功能食品。E-mail：wujing2003825@yahoo.com.cn