響應(yīng)面法優(yōu)化短短芽孢桿菌F M4 B的發(fā)酵培養(yǎng)基

芮廣虎，胡雪芹*，殷 坤，張洪斌

(合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

響應(yīng)面法優(yōu)化短短芽孢桿菌F M4 B的發(fā)酵培養(yǎng)基

芮廣虎，胡雪芹*，殷 坤，張洪斌

(合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

采用Plackett-Burman法考察發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分對(duì)抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：葡萄糖、蔗糖、K2HPO4的質(zhì)量濃度對(duì)抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量影響顯著。再采用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)3個(gè)主要因素進(jìn)行分析，得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO4 0.825、MgSO4·7H2O 0.5。采用該法優(yōu)化所得的培養(yǎng)基，其抑菌圈面積增加了42%。

短短芽孢桿菌；生物防治；Box-Behnken試驗(yàn)；響應(yīng)曲面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

近年來(lái)，食品安全得到了人們的普遍關(guān)注。由食品安全引發(fā)的問(wèn)題，已成為人類健康的主要影響因素，各國(guó)政府紛紛將保證和提高食品安全視為提高人民生活質(zhì)量、保持社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大戰(zhàn)略問(wèn)題[1]。然而，人均耕地面積日漸減少，要求提高單位面積作物產(chǎn)量，最大程度地減少病蟲害，導(dǎo)致大量使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行保護(hù)?；瘜W(xué)農(nóng)藥的廣泛使用，污染和破壞了生態(tài)環(huán)境，帶來(lái)了嚴(yán)重的后果，食品中殘留農(nóng)藥的毒害事故頻頻發(fā)生。因此，控制與消除化學(xué)農(nóng)藥污染，開(kāi)發(fā)與環(huán)境和諧的生物防治方法，已成為環(huán)境保護(hù)的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

農(nóng)作物的枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的土傳真菌性病害，難防難治。國(guó)內(nèi)外已有大量生物防治農(nóng)作物病蟲害的相關(guān)報(bào)道。據(jù)報(bào)道[2-5]，芽孢桿菌(Bacillusspp.)是一類在自然界中廣泛存在的微生物，可產(chǎn)生抗生素、細(xì)菌素、抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)。這類細(xì)菌多為革蘭氏陽(yáng)性菌，可以形成芽孢，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，對(duì)人畜無(wú)害[6]，是非常有價(jià)值的生防菌。

本實(shí)驗(yàn)室從西瓜植株根際周圍篩選到一株拮抗菌FM4B，經(jīng)鑒定為短短芽孢桿菌，離體條件下，其發(fā)酵液對(duì)多種枯萎病病菌的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，前期實(shí)驗(yàn)表明該菌及發(fā)酵液能降低西瓜枯萎病發(fā)病率，并能促進(jìn)西瓜植株的生長(zhǎng)[7]。因此，具有很好的研究?jī)r(jià)值及開(kāi)發(fā)前景。為了提高抗枯萎病菌活性物質(zhì)產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，可以快速地從眾多的試驗(yàn)因素中挑選出影響顯著的因素，對(duì)顯著因素做進(jìn)一步的優(yōu)化，得出最優(yōu)的培養(yǎng)基組成。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試生防菌為短短芽孢桿菌Brevibacillus brevisFM4B菌株，由本實(shí)驗(yàn)室提供；活性指示菌為西瓜枯萎病菌Fusariurn oxysporumf.sp.niveum，由上海交通大學(xué)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SL202N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ-500型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HQ45B型恒溫?fù)u床 中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

PDA培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、土豆200、瓊脂18，pH值自然。斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂18，pH7.0，28℃培養(yǎng)24h。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨23.1、K2HPO40.1、MgSO4·7H2O 0.5，pH7.5。

培養(yǎng)條件：從斜面上挑取3環(huán)接種到含50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶里，30℃、200r/min培養(yǎng)15h，得種子液。按5%的接種量接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28℃、180r/min培養(yǎng)21h，離心除菌體，得活性物質(zhì)發(fā)酵液。

1.4 抗真菌活性的測(cè)定方法

抗真菌活性的測(cè)定采用杯碟法，以沒(méi)有指示菌生長(zhǎng)的區(qū)域面積來(lái)表示抗菌活力。300μL指示菌孢子懸液(105CFU/mL)與50℃的20mL PDA培養(yǎng)基混合搖勻后倒平板。在凝固的平板上打孔(直徑6mm)，每孔中加入活性物質(zhì)發(fā)酵液100μL，28℃培養(yǎng)48h，觀察并計(jì)算抑菌圈面積。

1.5 方法

1.5.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果[8]， FM4B菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分主要有：葡萄糖、FeSO4·7H2O、蔗糖、黃豆餅粉、蛋白胨、NH4NO3、酵母膏、K2HPO4和MgSO4·7H2O。采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9-10]，見(jiàn)表1，擬合方程為：Y＝γ0＋γ1X1＋γ2X2＋γ3X3＋γ4X4＋γ5X5＋γ6X6＋γ7X7＋γ8X8＋γ9X9

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)分析因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)的因素作顯著性分析，找出主要因素。根據(jù)擬合函數(shù)回歸系數(shù)的符號(hào)和大小來(lái)設(shè)計(jì)主要因素的最陡上升路徑，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。試驗(yàn)組數(shù)由經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，步長(zhǎng)由主要因素的效應(yīng)值確定。通過(guò)使主要因素同時(shí)朝響應(yīng)值增大的方向變化，找出峰值，從而逼近最大的響應(yīng)區(qū)域[11-12]。

1.5.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]

根據(jù)1.5.1、1.5.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SAS (Version8.1)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸性分析，用t檢驗(yàn)驗(yàn)證回歸系數(shù)的顯著性，用F檢驗(yàn)評(píng)價(jià)模型方程的顯著性，方程的擬合性由R2確定。

1.6 模型驗(yàn)證

用SAS(Version8.1)對(duì)多元函數(shù)進(jìn)行擬合和方差分析。對(duì)自變量求偏導(dǎo)數(shù)，可確定出其極值點(diǎn)[10]。再按照計(jì)算所得到的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹貜?fù)性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)主要因素的篩選

采用Plackett-Burman法，對(duì)9個(gè)組分進(jìn)行考察。每個(gè)組分取高水平(＋1)和低水平(－1)，見(jiàn)表2。各組分所代表的高低水平和方差分析結(jié)果，見(jiàn)表3。

表2 Placket-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table2 Placket-Burman design and corresponding results

表3 各因素影響的主效應(yīng)分析Table 3 Main effects analysis of medium components

由表3可知，培養(yǎng)基組分對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響顯著性[13]的排序?yàn)椋浩咸烟牵菊崽牵綤2HPO4＞FeSO4·7 H2O＞黃豆餅粉＞酵母膏＞蛋白胨＞N H4N O3＞MgSO4·7H2O。顯然，葡萄糖、蔗糖和K2HPO4的影響較為突出，葡萄糖對(duì)于菌體產(chǎn)抑菌物質(zhì)呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，蔗糖和K2HPO4呈正效應(yīng)。這些效應(yīng)關(guān)系用方程式表示為：Y＝337.1667－62.5X1＋53.83333X3＋40.83333X8，方程R2＝0.9618，表明該回歸方程擬合良好。從方程中還可以看出，要提高產(chǎn)量，應(yīng)適當(dāng)降低葡萄糖質(zhì)量濃度，提高蔗糖和K2HPO4質(zhì)量濃度。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出的主要組分的效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長(zhǎng)，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找最大產(chǎn)量區(qū)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。最大產(chǎn)量區(qū)在試驗(yàn)號(hào)2附近。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Steepest ascent procedure and corresponding results

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 5 Factors and levels of response surface analysis

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以試驗(yàn)號(hào)2的條件為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5。采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定主要因素的最優(yōu)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。SAS(Version8.1)擬合出的回歸方程模型為：Y＝395.3333－19.75x1＋7.75x2－11x3－13.16667x12－4.5x1x3＋12.16667x22＋8.5x2x3－9.166667x32?；貧w方程的方差分析見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)和對(duì)應(yīng)結(jié)果Table 6 Box-Behnken design and corresponding response values

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for the proposed quadratic polynomial model

方程自變量平方項(xiàng)的符號(hào)皆為負(fù)值，則拋物線的開(kāi)口向下，所以有對(duì)應(yīng)的極大值點(diǎn)[10]。由方差分析得出大于F值的概率為0.003877，表明回歸方程模型的顯著性及可靠性很好；而且方程R2＝0.9651，表明了響應(yīng)模型可以解釋96.51%的總體變異情況，只有3.49%的變異無(wú)法用模型來(lái)解釋[14-16]，回歸模型有高度的相關(guān)性[17]。這個(gè)模型可以用于活性物質(zhì)產(chǎn)量的分析和預(yù)測(cè)。聯(lián)合響應(yīng)面回歸分析和回歸方程繪制的響應(yīng)面圖形如圖1～3所示。

圖1 x1與x2交互作用對(duì)Y值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x2

圖2 x2與x3交互作用對(duì)Y值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y versus x2 and x3

圖3 x1與x3對(duì)Y值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x3

通過(guò)觀察上述圖形的變化趨勢(shì)得出：x1、x2、x3在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在極大值點(diǎn)。這3個(gè)組分的最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)(x1,x2,x3)為(0.917, 0.500, 0.000)，即葡萄糖6.1g/L、蔗糖31.3g/L、K2HPO40.825g/L，在此點(diǎn)預(yù)測(cè)的抑菌圈面積為403mm2；x1x2交互作用的等高線近似圓形，則兩者的交互作用不顯著；x2x3和x1x3交互作用的等高線都是橢圓，則兩元素間的交互作用顯著[18]。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行3組裝液量為50mL/250mL的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所測(cè)的抑菌圈面積都在400mm2以上，平均值為405mm2。與模型預(yù)測(cè)值非常接近，表明設(shè)計(jì)模型能很好的預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況。

3 結(jié) 論

SAS全稱為Satistics Aalysis System，它是包括數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、運(yùn)籌等為題的科學(xué)計(jì)算等大量模塊的集成軟件系統(tǒng)。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法的優(yōu)越之處在于試驗(yàn)次數(shù)少，周期短，精度高[19]，從眾多的考察因素中挑選出影響試驗(yàn)的幾個(gè)主要因素，以供進(jìn)一步的深入研究[20]。響應(yīng)面法可以對(duì)影響生物產(chǎn)量的主要因素的含量和它們間的交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，確定出多因素體系的最優(yōu)解。

本研究通過(guò)采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響菌株FM4B代謝產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的9個(gè)組分進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析，篩選出葡萄糖、蔗糖、K2HPO4為影響產(chǎn)量的主要因素。然后根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定了培養(yǎng)基的最優(yōu)組分為(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO40.825、MgSO4·7H2O 0.5。發(fā)酵液的抑菌圈面積由原來(lái)的285mm2提高到405mm2，增加了42%，進(jìn)一步提高了FM4B菌株的抑菌活性。

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Medium Optimization for Antifungal Substance Production byBrevibacillus brevisFM4B Using Response Surface Methodology

RUI Guang-hu，HU Xue-qin*，YIN Kun，ZHANG Hong-bin
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of 9 medium components on the production of antifungal substance byBrevibacillus brevisFM4B. The results showed that glucose, peptone and K2HPO4 were the most important medium components. Steepest ascent procedure and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were employed to optimize the three medium components. The optimal fermentation medium for producing antifungal substance was composed of glucose 6.1 g/L, peptone 23.1 g/L, sucrose 31.3 g/L, K2HPO4 0.825 g/L and MgSO4·7H2O 0.5 g/L. The inhibition spot area of the optimized culture medium after fermentation withBrevibacillus brevisFM4B was increased by 42% compared to that of the original medium.

Brevibacillus brevis；biological control；central composite design；response surface methodology；medium optimization

S432.4

A

1002-6630(2012)15-0257-05

2011-06-16

合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2010052)

芮廣虎(1983—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镏扑幑こ?。E-mail：ruiguanghu2008@163.com

*通信作者：胡雪芹(1976—)，女，副教授，研究方向?yàn)槲⑸镏扑?。E-mail：huxueqin12345@163.com