高壓脈沖電場提取枸杞多糖工藝

蔡光華，王曉玲*

(西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

高壓脈沖電場提取枸杞多糖工藝

蔡光華，王曉玲*

(西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

采用高壓脈沖電場破壁方法，對影響枸杞多糖提取率(Y)的pH值(X1)、電場強度(X2)、脈沖頻率(X3)、溫度(X4)、液料比(X5)5個主要因素進行單因素和多因素分析。用SAS 9.1統(tǒng)計軟件對星點設(shè)計方案的結(jié)果進行完全二次響應(yīng)曲面的回歸模型的擬合與模型的嶺嵴分析。結(jié)果表明：當X1＝8.98，X2＝20.49kV/cm，X3＝ 10520Hz，X4＝61.76℃，X5 ＝9.43:1 (mL/g)時，枸杞多糖提取率最高(Ymax)，為13.26%。在此基礎(chǔ)上通過效應(yīng)面法預(yù)測得出工業(yè)提取的工藝范圍：X1＝8.50～9.00，X2＝15.00～25.00kV/cm，X3＝10000～11000Hz，X4 ＝ 20～40℃，X5＝ 9:1～10:1(mL/g)。

枸杞多糖；高壓脈沖電場；星點設(shè)計-效應(yīng)面法；提取工藝

枸杞作為我國傳統(tǒng)的藥食兼用的名貴中藥材，其味甘、性平，具有滋腎補髓，潤肺明目等功效[1]。多糖含量高(＞40%)是枸杞重要的化學特征[2]。近年來研究表明，枸杞具有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老[3]、抗腫瘤[4]、抗輻射[5]、保護生殖系統(tǒng)[6]，增加造血功能[7]、防止遺傳損傷[8]，降血脂和降血糖[9]等功能，并且這些藥理和保健作用與枸杞多糖高有很大關(guān)系[10]。目前，對枸杞多糖的提取方法例如酶法、微波、超聲堿水、加熱回流等有大量文獻報道，但這些方法均采用了傳統(tǒng)的破壁方法——物理法、化學法或生物法，其費時、費力、耗能。高壓脈沖電場(high-voltage pulsed electric field，HPEF)是一種新興的提取方法，其作用機理是利用細胞膜電穿孔原理在瞬間使細胞破壁，造成細胞膜電位混亂，細胞壁和細胞膜發(fā)生可逆或不可逆的破壞，細胞組分流出，區(qū)別于傳統(tǒng)的破壁原理[11]。本實驗采用HPEF破壁方法提取枸杞多糖，先進行單因素試驗，再在其基礎(chǔ)上運用星點設(shè)計-效應(yīng)面法[12]進行多因素試驗的設(shè)計和優(yōu)化，以期得到提取率最高的實驗方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏中寧縣特等枸杞子；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機 上海耶茂儀器儀表有限公司；AUX320分析天平 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司；721紫外可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；H-2100M2高速冷凍離心機 日本Kokusan Denki公司；DZF-6020真空干燥箱 南京五和試驗設(shè)備有限公司；CS501恒溫水浴 上海民儀電子有限公司；自制高壓脈沖電場設(shè)備(圖1) 民族藥物研究所。

1.3 枸杞多糖的提取工藝

1.3.1 原料預(yù)處理

取3kg枸杞，在60℃條件下真空干燥粉碎8h，用4倍體積的石油醚，水浴回流提取3h，以脫去油脂，抽濾后將殘渣風干。再加入4倍殘渣體積的體積分數(shù)80%乙醇，水浴回流提取3h，間歇攪拌，重復(fù)回流操作2次，以除去單糖、色素等，抽濾后將殘渣風干。殘渣依次用無水乙醇、丙酮、石油醚進行多次抽洗，風干儲存。

1.3.2 枸杞多糖的提取

采用雙極性方波高壓脈沖電場，有較高的提取效果[12]。HPEF處理設(shè)備裝置如圖1所示，高壓直流電源由220V交流電通過變壓器成幾十千伏的交流電，然后再經(jīng)過整流而成，充、放電過程由開關(guān)控制。處理條件：場強范圍為10～100kV/cm，頻率范圍為1～3000Hz。

圖1 HPEF處理裝置原理圖Fig.1 Schematic diagram of high-voltage pulsed electric field apparatus

將預(yù)處理殘渣使用高壓脈沖電場提取法進行提取，提取條件按照單因素和星點設(shè)計方案，水提液在5000r/min、5℃條件下冷凍離心30min去除雜質(zhì)，減壓濃縮，加5倍體積的體積分數(shù)95%乙醇醇析，于4℃冰箱靜置10h后濾過，重復(fù)3次醇析過程，將沉淀物合并用無水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次，離心去上清液，真空干燥后得枸杞粗多糖。

1.3.3 枸杞多糖的純化

采用Sevag法[13]去除枸杞粗多糖中含有的大量蛋白質(zhì)。用適量蒸餾水溶解粗多糖，混勻后按5:1(多糖水解液:氯仿-正丁醇，V/V)比例加入氯仿-正丁醇(5:1，V/V)混合液，振搖30min，可見蛋白質(zhì)成凝膠狀析出，在5000r/min、5℃條件下冷凍離心除去沉淀，離心除沉淀過程反復(fù)2至3次。上清液用4倍體積的乙醇醇沉3次，合并沉淀，即得脫蛋白枸杞多糖。將多糖溶解后加入適量體積分數(shù)為30%的H2O2，在50℃保溫脫色25min，然后4倍體積的乙醇醇沉3次，合并以后離心，取沉淀用體積分數(shù)95%的乙醇、丙酮、石油醚抽洗數(shù)次，最后用活性炭吸附法去除色素，于50℃真空干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，得到較純的枸杞多糖。

1.4 枸杞多糖的含量測定

1.4.1 標準曲線的繪制

用苯酚-硫酸法[14]測定多糖含量的標準曲線。精密稱取干燥質(zhì)量恒定葡萄糖0.006g，配成100mL溶液，搖勻，從中精密吸取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，分別加入30mL濃硫酸和6mL苯酚溶液，30℃恒溫0.5h，冷水浴冷卻至室溫，定容至50mL，按分光光度法于490nm波長處測定吸光度。所得標準曲線回歸方程為：Y＝9.76X＋0.215，R2＝0.9995，式中：Y為吸光度，X為葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.4.2 枸杞多糖提取率的測定

將枸杞多糖供試品，稀釋至適宜濃度。按1.4.1節(jié)方法測定A值，計算出葡萄糖的質(zhì)量濃度后，通過下式計算枸杞多糖提取率[15]：

式中：C為樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為溶液體積/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；3.19為葡萄糖換算成枸杞多糖的換算系數(shù)；W為枸杞質(zhì)量/g；10-3為單位換算系數(shù)。

1.5 最佳提取工藝的驗證

根據(jù)確定的最優(yōu)提取工藝，分別取6份樣品，進行驗證實驗，并將測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進行比較，并計算其相對偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPEF單因素試驗

2.1.1 溶液溫度

在脈沖數(shù)變頻9000Hz，pH8、液料比10:1(mL/g)、電場強度20kV/cm條件下，溫度對多糖提取率的影響如圖2所示，溫度小于60℃時，升溫有助于多糖的增溶，多糖的提取率逐漸提高；大于60℃時，熱堿溶液造成糖苷鍵斷裂，多糖降解，多糖提取率有較大下降的趨勢。因此確定最佳溶劑溫度為60℃，此時多糖提取率最大，為10.59%。

圖2 溶液溫度對枸杞多糖提取率的影響Fig. 2 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.2 電場強度

在溫度50℃、其余條件同2.1.1節(jié)實驗條件下，電場強度對多糖提取率的影響如圖 3 所示，電場強度小于20kV/cm時，多糖的提取率逐漸提高；大于20kV/cm時，多糖的提取率下降。這是由于隨著電場強度增加，運動加快的極性溶劑能夠更多地進入到細胞內(nèi)，使多糖更容易滲透出來，同時細胞內(nèi)、外的電場強度差異使細胞電極化，從而破壞細胞膜，使多糖更容易被提取，但過大的電場強度，對多糖有降解作用。因此確定最佳電場強度為20kV/cm，此時枸杞多糖提取率最大，為11.11%。

圖3 電場強度對枸杞多糖提取率的影響Fig.3 Effect of electric field intensity on extraction rate of polysaccharide

2.1.3 脈沖頻率

在電場強度20kV/cm、其余條件如2.1.2節(jié)條件下，脈沖頻率對多糖提取率的影響如圖4所示，脈沖頻率在6000～10000Hz，電場對植物細胞破壞的程度和數(shù)量都會相應(yīng)增加，因此多糖的提取率由3.34%增大到9.47%；但當脈沖頻率由10000Hz增大到14000Hz時，電場作用時間過長，電場頻率過大，造成多糖降解，多糖提取率由9.47%下降到8.47%。因此確定最佳脈沖頻率為10000Hz，此時對應(yīng)多糖提取率最大，為9.47%。

圖4 脈沖頻率對枸杞多糖提取率的影響Fig.4 Effect of pulse number on extraction rate of polysaccharide

2.1.4 液料比

在酶解頻率9000Hz，其余條件同2.1.3節(jié)條件下，液料比對多糖提取率的影響如圖5所示，多糖提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。液料比為10:1(mL/g)時，提取率最大，此時攪拌適宜，料泵工作效率高，對應(yīng)多糖提取率最大值為10.54%。但呈現(xiàn)下降趨勢的原因還不清楚，需要進一步研究。

圖5 液料比對枸杞多糖提取率的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide

2.1.5 pH值

圖6 pH值對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of pH on extraction rate of polysaccharide

在液料比10:1(mL/g)、其余條件同2.1.4節(jié)的實驗條件下，pH值對多糖提取率的影響如圖 6所示，由于低濃度的堿溶液對多糖有促融作用，高濃度的堿溶液對多糖有分解作用，因此隨pH值增大枸杞多糖提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。最終確定最佳pH值為10，此時對應(yīng)多糖提取率最大，為9.91%。

2.2 PEFE多因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 星點設(shè)計與結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行星點試驗設(shè)計，以多糖提取率(Y)為響應(yīng)變量，pH值(X1)、電場強度(X2)、脈沖頻率(X3)、溫度(X4)、液料比(X5)為影響因素。根據(jù)星點設(shè)計的原理，各因素水平設(shè)計見表 1，試驗安排與結(jié)果見表2[16]。

表1 星點設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Central composite design and results

續(xù)表2

2.2.2 試驗數(shù)據(jù)分析

2.2.2.1 完全二次響應(yīng)曲面的回歸模型的擬合與模型的嶺嵴分析

用SAS 9.1軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行二次響應(yīng)面回歸過程(RSREG)分析，RSREG過程擬合的完全二次響應(yīng)曲面的回歸模型如下(R2＝0.9110，擬合檢驗概率P＜0.0001)：

如表3 所示，回歸模型的相關(guān)系數(shù)較大，且各項的擬合檢驗概率均較小，說明模型較優(yōu)。通過嶺嵴分析，得出回歸模型的最佳響應(yīng)點Ymax＝13.26%，X1＝8.98，X2＝20.49kV/cm，X3＝10520Hz，X4＝ 61.76℃，X5＝9.43:1(mL/g)。 驗證實驗測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值相對偏差分別為1.51%、1.78%、1.01%、2.01%、1.38%、0.92%，平均值為1.44%，證明該擬合方程合理，方法可靠。

表3 各項因素擬合檢驗概率Table 3 Probability of fitting test for each term in the fitted regression model

2.2.2.2 響應(yīng)面法預(yù)測枸杞多糖得率較高的提取工藝范圍

根據(jù)擬合的二次回歸方程，用MATLAB R2010a 繪制任意兩因素對枸杞多糖提取率的三維響應(yīng)面圖(圖7)。

圖7 任意兩因素對枸杞多糖提取率的三維響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of five factors on extraction rate of polysaccharide

由圖7可知，脈沖頻率、pH值和液料比在與電場強度和溫度的分別交互作用中，對枸杞多糖的提取率影響很小，而電場強度和溫度對枸杞多糖的提取率起到很大的負面作用，說明在與其他因素的兩項相交互作用中，電場強度與溫度對枸杞多糖提取率起主導作用，這與單因素試驗中強電壓和熱堿對枸杞多糖起分解作用的結(jié)論也基本相符；而電場強度、pH值和液料比之間的交互作用，各個因素都呈現(xiàn)先正面影響后負面影響的趨勢，與單因素試驗結(jié)果基本相符。

通過對修正后的10個響應(yīng)面的比較觀察，結(jié)合嶺嵴分析中得到的最佳值和單因素試驗結(jié)果，得出5個因素比較佳的工藝范圍X1＝8.50～9.00，X2＝15.00～25.00kV/cm，X3＝10000～11000Hz，X4＝20～40℃，X5＝9:1～10:1(mL/g)。其中，脈沖頻率和液料比的較佳工藝范圍容易得出。要得出pH值、電場強度和溫度的較佳工藝范圍，除了要把最佳提取條件、交互影響中的影響趨勢和單因素試驗中的較佳條件考慮在內(nèi)，還要斟酌工業(yè)應(yīng)用中的限制條件(耗能，設(shè)備損耗等)：①提取液pH值太大，除了對多糖的降解作用，其對設(shè)備的腐蝕是必須要認真對待的問題，故選擇pH8.50～9.00的弱堿性條件。②能在較低電場強度下得到較高的提取率，是理想的選擇，故電場強度范圍應(yīng)當偏低15.00～25.00kV/cm。③溫度屬最次要因素，且在兩項交互作用中其變化并沒有較大幅度改變枸杞多糖的提取率，從節(jié)能的角度出發(fā)，最終確定較佳工藝溫度范圍為20～40℃。

遺憾的是該方程存在缺少三個或四個因素交互影響的缺陷，本實驗嘗試過對完全三次或四次回歸模型擬合，由于擬合模型R2都小于0.70，方程的擬合檢驗概率P都大于0.05，誤差太大，不能取用。

3 結(jié) 論

對枸杞多糖提取數(shù)據(jù)的完全二次響應(yīng)曲面的回歸模型的擬合，誤差較小，基本上滿足了對交互影響的分析要求。

相較傳統(tǒng)的提取工藝，本工藝能夠在較短時間內(nèi)完成，且耗能少，試劑損耗低，提取率較高，應(yīng)引起重視。高壓脈沖電場在食品加工、天然產(chǎn)物提取等領(lǐng)域中已有廣泛的應(yīng)用，其設(shè)備適用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，頗具良好的商業(yè)化前景。

[1] 魏永祥, 商希禮. 枸杞多糖的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(11): 5834-5836.

[2] CHANG R C C, SO K F. Use of anti-aging herbal medicine, lycium barbarum, against aging-associated diseases. What do we know so far?[J]. Cellular and Molecular Neurobiology, 2008, 28(5): 643-652.

[3] 蔣萬志, 張洪泉. 枸杞多糖在免疫和抗衰老方面的研究進展[J]. 中國野生植物資源, 2010, 29(2): 5-7.

[4] 何彥麗, 羅容敬, 杜標炎, 等. 枸杞多糖抗小鼠實驗性肝癌的作用機制[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報, 2010, 30(1): 28-30.

[5] 孫桂菊, 左平國. 枸杞多糖功效研究及應(yīng)用狀況[J]. 東南大學學報,2010, 29 (2): 209-215.

[6] LUO Qing, LI Zhuoneng, HUANG Xiaolan, et al. Lycium barbarum polysaccharides: protective effects against heat-induced damage of rat testes and H2O2-induced DNA damage in mouse testicular cells and beneficial effect on sexual behavior and reproductive function of hemicastrated rats[J]. Life Sciences, 2006, 79(7): 613-621.

[7] 方建國, 丁水平, 田庚元. 枸杞多糖藥理作用與臨床應(yīng)用[J]. 藥學新進展, 2004, 23(7): 484-486.

[8] ZHANG Min, CHEN Haixia, HUANG Jin, et al. Effect of Lycium barbarum polysaccharide on human hepatoma QGY7703 cells: inhibition of proliferation and induction of apoptosis[J]. Life Sciences, 2005,76(18): 2115-2124.

[9] 潘正軍, 劉暢, 張燕, 等. 枸杞多糖對高血壓孕鼠腎臟胎盤及胎鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(6): 1528-1530.

[10] YIN Yongguang, ZHANG Qinghua, SASTRY S K. High voltage pulsed electric field treatment chambers for the preservation of liquid food products: US, 5690978[P]. 1997-11-4.

[11] 魏殿文, 莊澤帥, 徐海軍. 高壓脈沖電場法提取天然產(chǎn)物的研究進展[J]. 國土與自然資源研究, 2010, 29(2): 209-215.

[12] RODRIGUES R C, VOLPATO G, AYUB M A Z, WADA K. Lipasecatalyzed ethanolysis of soybean oil in a solvent-free system using central composite design and response surface methodology[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2008, 83(6): 849-854.

[13] 李蘋蘋, 丁霄霖. 紫貽貝多糖脫除蛋白質(zhì)方法的研究[J]. 上海水產(chǎn)大學學報, 2006, 15(3): 327-331.

[14] 葉玉娣. 不同等級枸杞中枸杞多糖的含量測定與比較[J]. 浙江中醫(yī)雜志, 2009, 44(12): 921-922.

[15] 胡仲秋, 王利, 王保玲, 等. 枸杞多糖提取及消除羥自由基活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(24): 93-98.

[16] MOLPECERESX J, GUZMAN M, ABERTURAS M R, et al. Application of central composite designs to the preparation of polycaprolactone nanoparticles by solvent displacement[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1996, 85(2): 206-213.

Extraction of Polysaccharides from Chinese Wolfberry (Lycium barbarum L.) Fruits by High Intensity Pulsed Electric Fields

CAI Guang-hua，WANG Xiao-ling*
(Ethnic Pharmaceuitical Institute, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

One-factor-at-a-time and central composite designs was used to analyze five crucial variables that influence extraction rate of polysaccharides from Chinese wolfberry fruits by high intensity pulsed electric fields (HPEF) including pH (X1), pulse number (X2), electric field strength (X3), temperature (X4) and material-to-liquid ratio (X5). Based on the experimental data of star point designs, a full quadratic response surface regression model was constructed with SAS 9.1 software and used for ridge analysis of response surfaces. When X1, X2, X3, X4 and X5 were 8.98, 20.49 kV/cm, 10520, 61.76 ℃ and 1:9.43 g/mL, respectively,the highest polysaccharide yield, 13.26%, was obtained. According to response surface predictions, the appropriate levels of X1,X2, X3, X4 and X5 for industrial extraction of polysaccharides from Chinese wolfberries were in the range of 8.50－9.00, 15.00－2.00 kV/cm, 10000－11000, 20－40 ℃ and 1:9－1:10 (g/mL), respectively.

Chinese wolfberry polysaccharide；high intensity pulsed electric fields；central composite design-response surface methodology；extraction process

R284.2；R285.5

A

1002-6630(2012)08-0043-06

2011-04-13

西南民族大學研究生學位點建設(shè)項目(2012XWD-S0703)

蔡光華(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為天然藥物化學。E-mail： hhhhhh_112233@yahoo.com.cn

*通信作者：王曉玲(1971—)，女，教授，博士，研究方向為天然藥物化學。E-mail：wxl3232@sina.com