副溶血弧菌的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法建立

張曉君，陳 麗，畢可然，秦 蕾，秦國民

(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 連云港 222005)

副溶血弧菌的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法建立

張曉君，陳 麗，畢可然，秦 蕾，秦國民

(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 連云港 222005)

基于副溶血弧菌gyrB基因保守序列設(shè)計1對特異性引物，建立SYBR GreenⅠ實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測副溶血弧菌的方法。SYBR GreenⅠ實時定量PCR的Tm為90℃，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線只出現(xiàn)1個單特異峰，無引物二聚體，表明該引物具有較好的特異性；所制作的實時定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.06×108～2.06×103拷貝數(shù)之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.992，能對副溶血弧進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。該方法檢測時間從核酸抽提到結(jié)果分析僅需4～5h，且較傳統(tǒng)方法敏感、操作簡單，可用于針對副溶血弧菌的進(jìn)出口檢驗檢疫、食品安全檢測及該菌引起的水產(chǎn)動物疾病的診斷與分子流行病學(xué)調(diào)查。

副溶血弧菌；gyrB基因；SYBR GreenⅠ；實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)早在1950年在日本大阪市發(fā)生的食物中毒病例中分離獲得，之后在世界許多國家如中國、澳大利亞、印度、美國、越南、泰國、多哥、馬來西亞、新加坡、俄羅斯、巴拿馬、新西蘭、羅馬尼亞、墨西哥等均陸續(xù)報告了副溶血弧菌食物中毒或腸炎。同時該菌廣泛存在于世界各地近海岸的海水、海底沉積物及海產(chǎn)品中，是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原細(xì)菌，可引起魚、蝦、蟹、貝等多種水產(chǎn)動物感染發(fā)病[1-4]，嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)。因此選擇合適的分子靶標(biāo)，研究開發(fā)操作簡便、快速且特異性強(qiáng)的病原副溶血弧菌快速檢測方法，對食品中針對副溶血弧菌安全檢測及該菌引起的水產(chǎn)動物疾病的快速診斷，具有重要的實踐意義。

gyrB基因編碼的是惟一能誘導(dǎo)DNA負(fù)超螺旋的拓?fù)洚悩?gòu)酶——DNA促旋酶的B亞單位蛋白，Yamamoto等[5]1995年設(shè)計出通用引物可從許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌成功擴(kuò)增出gyrB基因，特別適合作為分子靶標(biāo)進(jìn)行細(xì)菌種間鑒別。gyrB基因是副溶血弧菌DNA復(fù)制所必需的，具有副溶血弧菌種特異性，而且為單拷貝基因，具有設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物的保守區(qū)域[6]。SYBR GreenⅠ是一種與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料，與雙鏈DNA結(jié)合后, 其熒光大大增強(qiáng)，且其熒光強(qiáng)度的增加與雙鏈DNA的數(shù)量呈正比，而不摻入鏈中的SYBR GreenⅠ染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，因此可以根據(jù)熒光信號檢測出反應(yīng)體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量。本實驗以編碼gyrB基因為靶基因，建立SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測副溶血弧菌的方法，通過實驗證實該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測耗時短，是定量檢測副溶血弧菌的有效且廉價的方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源及引物設(shè)計合成

供試副溶血弧菌分離自江蘇連云港市贛榆縣發(fā)病凡納濱對蝦幼蝦及三疣梭子蟹；陰性對照鰻弧菌(V.anguillarum)、哈氏弧菌(V.harveyi)、美人魚弧菌(V.damselae)、魚腸道弧菌(V.ichthyoenteri)、河口弧菌(V.aestuarianus)、殺對蝦弧菌(V.penaeicida)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)及愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)均分離自海水魚，由本實驗室保存。

在GenBank上獲得副溶血弧菌及其他細(xì)菌的gyrB基因的DNA序列，采用DNA Star軟件進(jìn)行同源性分析，確定在副溶血弧菌菌株內(nèi)保守、其他菌株間特異的片段，利用生物軟件Primer 5.0對該保守片段設(shè)計副溶血弧菌的特異性檢測引物：vp-gyrB-F：CGG CGT GGG TGT TTC GGT AGT；vp-gyrB-R：TCC GCT TCG CGC TCA TCA ATA，由上海生物工程技術(shù)公司合成。

1.2 細(xì)菌模板DNA提取及gyrB標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

供試菌模板DNA按上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒所述方法提取。

以60μL反應(yīng)體系擴(kuò)增副溶血弧菌gyrB基因，反應(yīng)體系中含有雙蒸水43.2μL、10×PCR緩沖液6μL、MgCl2(25mmol/L)4.8μL、4×dNTP混合物1.2μL、vpgyrB-F和vp-gyrB-R引物各0.6μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.6μL、模板DNA 3μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性20s、55℃復(fù)性20s、72℃延伸15s，35個循環(huán)，然后72℃溫育5min；瓊脂糖凝膠電泳檢測后用上海生物工程技術(shù)公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、純化，將回收純化的gyrB基因的PCR產(chǎn)物，利用大連寶生物公司生產(chǎn)的PMD18T載體進(jìn)行連接，連接3h，連接完畢后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取15個白色克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，以確證為陽性克隆。取2個陽性克隆用上海生物工程技術(shù)公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。用核酸蛋白分析儀測量質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿佛加德羅常數(shù)換算出每毫升質(zhì)粒中的DNA的拷貝數(shù)，作為本研究的標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本。

1.3 副溶血弧菌SYBR GreenⅠ熒光RT-PCR檢測方法的建立

1.3.1 反應(yīng)體系優(yōu)化

設(shè)立引物濃度梯度為0.1～0.5μL(10μmol/L)以確定反應(yīng)的最佳引物濃度；優(yōu)化退火溫度(55～62℃)，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以得到最小的Ct值并且在熔解曲線中不產(chǎn)生非特異性峰為指標(biāo)。

1.3.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用構(gòu)建好的PMD18-gyrB重組質(zhì)粒作為副溶血弧菌定量標(biāo)準(zhǔn)品，對定量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，共稀釋6個梯度，利用優(yōu)化好的熒光PCR反應(yīng)條件檢測各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值。以質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)，建立質(zhì)?？截悵舛扰cCt值對應(yīng)關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 SYBR GreenⅠ熒光RT-PCR檢測副溶血弧菌方法的初步應(yīng)用

采取扇貝、脊尾白蝦、中國對蝦、雜色蛤等海產(chǎn)品，無菌操作取其肌肉組織用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，人工染副溶血弧菌后進(jìn)行研磨，研磨液用水煮法提取細(xì)菌模板DNA，按上述方法進(jìn)行熒光PCR檢測；通過樣品的擴(kuò)增曲線及Ct值及熔解曲線進(jìn)行結(jié)果判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

圖1 引物特異性檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of primers

以vp-gyrB-F和vp-gyrB-R為引物，對副溶血弧菌(2株)、鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌、魚腸道弧菌、河口弧菌、殺對蝦弧菌、殺鮭氣單胞菌及愛德華氏菌模板DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅2株副溶血弧菌擴(kuò)增出大小為285bp的目的基因片段，其他8種細(xì)菌均為陰性結(jié)果，結(jié)果表明該實驗所使用的引物具有較強(qiáng)的特異性(圖1)。

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

PMD18-gyrB基因重組質(zhì)粒經(jīng)分光光度計測定，其質(zhì)量濃度為66ng/μL，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)換算出每毫升重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為2.06×1010，該重組質(zhì)粒稀釋成2.06×108作為定量標(biāo)準(zhǔn)品原液保存。

2.3 反應(yīng)優(yōu)化條件

20μL反應(yīng)體系包括雙蒸水8.6μL、SYBR GreenⅠHotstar Fluo-PCR mix(上海生物工程技術(shù)公司生產(chǎn)) 10μL、正反向引物各0.2μL、1μL標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒；定量PCR反應(yīng)條件：94℃、4min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，進(jìn)行45個循環(huán)。PMD18-gyrB基因重組質(zhì)粒在2.06×108～2.06×103拷貝數(shù)范圍的定量PCR，其擴(kuò)增曲線反映了PCR的指數(shù)增長階段和平臺階段(圖2)。

圖2 SYBR GreenⅠ實時定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of SYBR green I-based real-time PCR

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

圖3 SYBR GreenⅠ實時定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of SYBR green I-based real-time PCR

利用優(yōu)化好的副溶血弧菌RT-PCR反應(yīng)體系對7個10倍梯度稀釋的定量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立質(zhì)粒拷貝質(zhì)量濃度的對數(shù)值與Ct值對應(yīng)關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。結(jié)果顯示，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.06～108～2.06×103拷貝數(shù)之間的Ct值相差比較均勻，符合定量PCR的Ct值與起始拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)為0.992，斜率約為－2.597，截距為33.199，得出細(xì)菌拷貝數(shù)與Ct值的線性方程為 Ct＝－2.597X＋33.199。在對樣品進(jìn)行檢測時，根據(jù)其Ct值和線性方程可以獲得該樣品DNA拷貝數(shù)。

2.5 熒光定量PCR的溶解曲線

利用優(yōu)化好的副溶血弧菌RT-PCR反應(yīng)體系對6個10倍梯度稀釋的PMD18-gyrB基因重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示熔解曲線均只有1個熔解峰，Tm值為90℃，表明反應(yīng)過程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體(圖4)。

2.6 水產(chǎn)品人工染菌樣品的檢測

圖4 SYBR GreenⅠ實時定量PCR溶解曲線Fig.4 Melting curves of SYBR green Ⅰ-based real-time PCR

利用本研究建立的副溶血弧菌SYBR GreenⅠ實時定量PCR方法，對扇貝、脊尾白蝦、中國對蝦、雜色蛤等人工染菌的4種海產(chǎn)品進(jìn)行檢測，PCR的Ct值與DNA拷貝數(shù)之間的定量曲線見圖5。結(jié)果顯示，扇貝樣品Ct值為24.73，其DNA拷貝數(shù)為1.832×103，脊尾白蝦Ct值在24.87，其DNA拷貝數(shù)為1.61×103，中國對蝦Ct值在23.38，其DNA拷貝數(shù)為6.02×103，雜色蛤Ct值在25.16，其DNA拷貝數(shù)為1.25×103，4個人工染菌樣品均成陽性反應(yīng)，結(jié)果表明，該熒光PCR方法具有較好的適用性。

圖5 SYBR GreenⅠ實時定量PCR樣品檢測曲線Fig.5 Detection curves of SYBR green Ⅰ-based real-time quantitative PCR for samples

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用于副溶血性弧菌檢測的分子生物學(xué)方法已越來越多，如隨機(jī)引物PCR (arbitrarily primed PCR，APPCR)[7]、脈沖場電泳(pulsed field gelelectrophoresis，PFGE)[8]、基因芯片[9]等。PCR技術(shù)以其敏感、特異、簡便和快速等優(yōu)點廣泛地應(yīng)用于副溶血弧菌的檢測，其PCR檢測的靶基因主要有tlh、tdh、trh、gyrB和toxR等[10]，Bej等[11]開發(fā)了以tlh、tdh及trh為靶基因的多重PCR用來檢測貝類產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，黃曉蓉等[12]亦以tlh、tdh及trh為靶基因建立了食品中副溶血性弧菌的多重PCR檢測。然而，強(qiáng)致病性的tdh和trh基因很少在副溶血性弧菌環(huán)境分離株中出現(xiàn)，并且tdh和trh基因都不是單一基因，而gyrB基因具有副溶血弧菌種特異性，而且為單拷貝基因。因此，本研究選擇gyrB基因作為擴(kuò)增的靶基因檢測副溶血弧菌，普通PCR的特異性實驗結(jié)果表明，引物(vpgyrB-F和vp-gyrB-R)僅對所檢測的副溶血弧菌可擴(kuò)增出大小為285bp的基因片斷，對水產(chǎn)動物其他病原細(xì)菌(鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌、魚腸道弧菌、河口弧菌、殺對蝦弧菌、殺鮭氣單胞菌及愛德華氏菌)的檢測均呈陰性反應(yīng)，說明該引物對副溶血弧菌具有良好的特異性，可用于針對副溶血弧菌的進(jìn)出口檢驗檢疫、食品安全檢測及該菌引起的水產(chǎn)動物疾病的診斷與分子流行病學(xué)調(diào)查。

有關(guān)副溶血弧菌的熒光定量PCR技術(shù)，國內(nèi)外學(xué)者也多有報道。Blackstone等[13]建立了1種基于Taq Man探針的快速定量檢測含tdh的副溶血弧菌的實時PCR方法；蔡潭溪等[14]根據(jù)gyrB基因序列設(shè)計和合成1對引物和1個Taq Man探針建立了一種定量檢測副溶血弧菌的方法。本實驗建立的副溶血弧菌的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法與Taq Man探針法相比，操作簡單，不需要設(shè)計合成昂貴的探針，只需在SYBR GreenⅠ反應(yīng)混合液中加入引物和待測樣品的DNA；與普通PCR相比，SYBR GreenⅠPCR擴(kuò)增完成后，可以直接對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，方便且省時，從核酸的提取到定量PCR反應(yīng)完成只需要4～5h，使用i cycler iQ5多通道熒光定量PCR儀1次可以進(jìn)行96個樣品的高通量檢測，模板質(zhì)量濃度范圍寬、靈敏度高，且重復(fù)性好。

由于SYBR GreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。熒光染料法實時定量PCR檢測的結(jié)果分析軟件，其熔解曲線功能可以幫助確定PCR生成幾種產(chǎn)物、有無二聚體，從而得到定量結(jié)果。本研究的PMD18-gyrB基因重組質(zhì)粒及檢測樣品熔解曲線均只有1個熔解峰，Tm值為90℃，表明反應(yīng)過程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

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Development of SYBR Green-Based ⅠReal-time Quantitative PCR for Detection of Vibrio parahaemolyticus

ZHANG Xiao-jun，CHEN Li，BI Ke-ran，QIN Lei，QIN Guo-min
(College of Ocean, Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

The gyrB gene, which encodes the B subunit protein of DNA gyrase, is a single copy gene and has conserved regions for PCR primers. A pair of specific primers target to the gyrB gene of V. parahaemolyticus was designed, and a SYBR green I-based real-time PCR for V. parahaemolyticus detection was established. The PCR primers could amplify 285-bp gene fragment from chromosomal DNA of V. parahaemolyticus, and no positive reaction was detected in 8 other pathogenic bacteria using conventional PCR. In addition, the results of melting curve analysis showed only a specific peak with a melting temperature (Tm) of 90 ℃, and no primer-dimers peak was observed. These findings indicated that the PCR primers had high specificity. Both geometric growth and plateau phases were observed in PCR amplification curves. Analysis of standard curves revealed excellent correlation between the number of copies (in the range of 2.06 × 108to 2.06 × 103) and PCR threshold cycle (Ct) with a correlation coefficient of 0.992 (R2＝0.992). It took only 4－5 h (from nucleic acid extraction to analysis of results) to detect samples by the method. Therefore, SYBR green-based I real-time PCR had the advantages of higher sensitivity and ease of operation over traditional methods and could be used for inspection and quarantine of import and export commodities, food safety detection, and diagnostic studies and molecular epidemic survey of aquatic animal diseases caused by V. parahaemolyticus.

Vibrio parahaemolyticus；gyrB gene；SYBR green I；real-time PCR

S941

A

1002-6630(2012)08-0203-04

2011-04-07

江蘇省水產(chǎn)三項工程項目(PJ2010-58)；連云港市科技攻關(guān)項目(CG1134)；江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2009163)

張曉君(1969—)，女，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動物病害及病原微生物學(xué)研究。E-mail：zxj9307@163.com