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      響應(yīng)曲面法優(yōu)化仲丁胺氣相色譜檢測(cè)的衍生條件

      2012-10-28 08:16:38紀(jì)淑娟于蘭潔
      食品科學(xué) 2012年8期
      關(guān)鍵詞:回歸方程反應(yīng)時(shí)間回收率

      紀(jì)淑娟,于蘭潔,劉 玲,白 冰,周 丹

      (沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866)

      響應(yīng)曲面法優(yōu)化仲丁胺氣相色譜檢測(cè)的衍生條件

      紀(jì)淑娟,于蘭潔,劉 玲,白 冰,周 丹

      (沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866)

      利用響應(yīng)面法優(yōu)化仲丁胺氣相色譜檢測(cè)的衍生條件。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,針對(duì)試驗(yàn)中衍生化反應(yīng)這一重要環(huán)節(jié),在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以仲丁胺回收率為響應(yīng)值,應(yīng)用響應(yīng)曲面法研究衍生反應(yīng)時(shí)間、溫度、衍生劑用量各因素間的交互作用及其對(duì)仲丁胺測(cè)定回收率的影響。以五氟苯甲醛溶液作為衍生劑,經(jīng)氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器分析測(cè)定。確定最佳衍生條件為:衍生反應(yīng)時(shí)間31.72min、衍生反應(yīng)溫度22.42℃、衍生劑用量1.25mL。

      仲丁胺;殘留;衍生;響應(yīng)曲面法;氣相色譜

      仲丁胺(sec-butylamine,2-AB),分子式為CH3CH (NH2)C2H5,是具有對(duì)映異構(gòu)現(xiàn)象的簡(jiǎn)單二級(jí)胺,有刺激性氨臭味,呈無(wú)色液體狀,有較強(qiáng)的揮發(fā)性。可以任意比例與水混溶并可溶于多種有機(jī)溶劑[1-3]。仲丁胺具有一定的毒性,人們食用含有仲丁胺的食品后,可隨尿液排出一部分,另一部分積累在腎臟中。動(dòng)物試驗(yàn)表明,白鼠(rat)的半致死劑量(LD50)為380mg/kg,美國(guó)將其歸為三級(jí)危險(xiǎn)品。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)規(guī)定仲丁胺的每日允許攝入量(acceptable daily intake,ADI)為0~0.1mg/kg[4]。

      仲丁胺可以有效地抑制根霉、青霉和綠霉等真菌的生長(zhǎng)和繁殖,我國(guó)允許其在一定范圍內(nèi)用作果蔬防腐保鮮劑,目前,主要應(yīng)用于柑橘、檸檬、蘋果、蒜薹、青椒等果品蔬菜的貯運(yùn)保鮮。GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn):蒜薹、青椒、柑橘、葡萄中仲丁胺殘留量測(cè)定》規(guī)定仲丁胺殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)為:柑橘果肉0.005mg/kg、荔枝果肉0.009mg/kg、蘋果果肉0.001mg/kg;新鮮蔬菜(蒜薹和青椒)3mg/kg。目前,我國(guó)檢測(cè)仲丁胺殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法為NY/T 946—2006《蒜薹、青椒、柑橘、葡萄中仲丁胺殘留量測(cè)定》,該方法采用薄層色譜法,檢出限較高。本實(shí)驗(yàn)采用仲丁胺衍生化后氣相色譜法測(cè)定的技術(shù)路線,重點(diǎn)對(duì)衍生反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選,以期為建立可靠、穩(wěn)定、靈敏的仲丁胺殘留量檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)[5-8]。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      正己烷(色譜純)、乙腈(色譜純) 杭州阿拉丁公司;仲丁胺(純度≥99.5℅) 四川西亞試劑;五氟苯甲醛(≥98%) 美國(guó)Acros公司;氫氧化鈉(分析純) 中國(guó)國(guó)藥集團(tuán);無(wú)水硫酸鈉(分析純) 沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠;聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP 分析純) 德國(guó)Sigma公司;DB1701毛細(xì)管柱 美國(guó)Agilent公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      CP3800氣相色譜儀 美國(guó)Varian公司;渦旋震蕩儀 德國(guó)IKA公司;HY-2調(diào)速多用振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;KQ5200超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 衍生

      衍生劑的配制:準(zhǔn)確稱取0.5μL五氟苯甲醛(PFB),用乙腈定容至10mL,體積分?jǐn)?shù)0.05μL/mL。

      在10mL仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入1mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液,使體系處于pH12的堿性環(huán)境,搖勻后加入衍生劑溶液,在一定溫度下恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后,用2mL正己烷分兩次振蕩提取衍生產(chǎn)物五氟芐亞胺,收集提取液,加入1mL 0.1mol/L氫氧化鈉,洗滌未反應(yīng)完全的衍生劑,收集正己烷,用無(wú)水硫酸鈉脫水,供氣相色譜儀測(cè)定[9-11]。

      1.3.2 色譜條件

      色譜柱:DB1701毛細(xì)管柱(30m×320μm,0.25μm),不分流進(jìn)樣,載氣為高純度氮?dú)?99.999%),升溫程序:以80℃為初始溫度,保持5min,以3℃/min升溫至130℃,再以20℃/min,升溫至250℃,保持10min,全程33.52min,進(jìn)樣口溫度:250℃,檢測(cè)器溫度:350℃,流速1.5mL/min,進(jìn)樣量1.0μL,外標(biāo)法定量[11-16]。

      1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

      0.1mg/kg仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確量取仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)品1.39μL,用蒸餾水定容至10.0mL,準(zhǔn)確移取其中1.0mL,蒸餾水定容至10.0mL,依次10倍比例稀釋,最終得到0.1mg/kg仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

      分別移取0.1mg/kg仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1、2、3、4、5、6mL于10.0mL容量瓶中,用蒸餾水定容,得到含量分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/kg的仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)工作液,衍生后測(cè)定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方法

      應(yīng)用Minitab 15 中文軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[17-20]。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

      不同質(zhì)量濃度的仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)氣相色譜測(cè)定,得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,線性回歸方程為:y=1297.3x+48.503,R2=0.9966(x為質(zhì)量濃度(mg/mL),y為峰面積)。當(dāng)仲丁胺質(zhì)量濃度在0~0.06mg/mL時(shí),其質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

      圖1 仲丁胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of sec-butylamine

      2.2 單因素試驗(yàn)

      2.2.1 衍生反應(yīng)溫度的篩選

      在衍生時(shí)間30min、衍生劑用量1mL條件下考察衍生溫度對(duì)衍生反應(yīng)效果的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。

      圖2 衍生反應(yīng)溫度對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on recovery rate of sec-butylamine

      由圖2可知,衍生反應(yīng)溫度在20~30℃范圍內(nèi),仲丁胺的回收率比較平穩(wěn),且均高于85%,當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí),回收率呈急劇下降趨勢(shì)。因此,初步確定衍生反應(yīng)的適宜溫度20~30℃。

      2.2.2 衍生反應(yīng)時(shí)間的篩選

      在反應(yīng)溫度25℃、衍生劑用量1mL條件下考察衍生時(shí)間對(duì)回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

      由圖3可見(jiàn),當(dāng)衍生反應(yīng)時(shí)間為20~50min時(shí),仲丁胺的回收率均可達(dá)到80%以上;當(dāng)衍生時(shí)間超過(guò)50min時(shí),仲丁胺的回收率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而大幅下降。這可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng),衍生反應(yīng)產(chǎn)物部分分解損失的緣故。因此,初步確定反應(yīng)時(shí)間在20~50min較為適宜。

      圖3 衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of reaction time on recovery rate sec-butylamine

      2.2.3 衍生劑用量的確定

      在反應(yīng)溫度25℃、反應(yīng)時(shí)間30min條件下,考察衍生劑用量對(duì)回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。

      圖4 衍生劑用量對(duì)回收率的影響Fig.4 Effect of derivatization reagent on recovery rate of sec-butylamine

      圖4表明,衍生劑用量對(duì)檢測(cè)效果影響較大,隨著衍生劑用量的增加,回收率呈逐漸遞增的趨勢(shì),其中,衍生劑用量為0.5mL時(shí),回收率低于70%,衍生劑用量為0.75~1.25mL時(shí),仲丁胺的回收率在80%~120%之間,而當(dāng)衍生劑用量超過(guò)1.25mL時(shí),回收率大于120%,可能是由于過(guò)量的衍生劑本身對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾的緣故。因此,初步確定適宜的衍生劑用量為0.75~1.25mL。

      2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化衍生反應(yīng)條件

      2.3.1 仲丁胺衍生反應(yīng)條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、衍生劑用量三個(gè)衍生反應(yīng)關(guān)鍵因素進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)中,采用三因素三水平響應(yīng)面分析法,重復(fù)3次,以隨機(jī)次序進(jìn)行的15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類,第1類是12個(gè)析因點(diǎn),自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);第2類是3個(gè)零點(diǎn),為區(qū)域的中心點(diǎn),用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

      表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

      表2 仲丁胺衍生反應(yīng)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

      將表2中不同條件下所測(cè)得的仲丁胺回收率,應(yīng)用Design Expert 7.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸擬合,根據(jù)表3中顯示的方程中各項(xiàng)P值的顯著性,去掉P值不顯著項(xiàng),得到仲丁胺回收率的回歸方程:Y=99.4-0.975X2+31.925X3-1.25X1X2-4.35X1X3-11X12-8.65X22。

      2.3.2 模型方差分析

      利用Design Expert 7.1 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到回歸方程模型的方差分析和回歸方程系數(shù)估計(jì)值,如表3所示。

      由表3可知,3個(gè)因素的P值相差較大,對(duì)回收率結(jié)果的影響順序?yàn)椋貉苌鷦┯昧?X3)>衍生溫度(X2)>衍生時(shí)間(X1),其中衍生劑用量和衍生溫度的一次項(xiàng)回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平;衍生溫度(X2)和衍生時(shí)間(X1)的二次項(xiàng)回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平;衍生時(shí)間(X1)與衍生溫度(X2)、衍生時(shí)間(X1)與衍生劑用量(X3)的二次項(xiàng)回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平,說(shuō)明他們之間存在明顯交互作用。

      表3 二次回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of regression equation coefficients in the fitted regression model

      表4 中心組合設(shè)計(jì)二次模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression model

      從表4可知,模型P<0.01,達(dá)到極顯著,表明不同處理之間差異極顯著。模型失擬項(xiàng)P=0.074>0.05,模型失擬項(xiàng)不顯著,模型選擇合適。由此可見(jiàn),各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R2=99.42%>0.8,說(shuō)明回收率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度,表明該數(shù)學(xué)模型中3個(gè)因素對(duì)仲丁胺回收率的影響達(dá)0.9942%,而其他因素的影響和誤差占0.58%,即只有0.58%的變異不能由該模型解釋,因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值仲丁胺回收率的實(shí)際情況。2.4 雙因素交互作用分析

      圖5 各因素交互作用對(duì)仲丁胺回收率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of derivatization conditions on recovery rate of sec-butylamine

      為了分析任意兩因素交互作用的影響,固定三個(gè)因素中任意一個(gè)因素在零水平,研究另兩個(gè)因素的交互效應(yīng),其響應(yīng)面與等高線圖見(jiàn)圖5。

      如圖5A所示,在反應(yīng)時(shí)間處于較低水平的情況下,隨著反應(yīng)溫度的升高,回收率呈現(xiàn)從急劇升高到急劇降低的變化趨勢(shì),而在衍生反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),隨著反應(yīng)溫度的升高,回收率呈現(xiàn)從急劇下降到急劇升高的趨勢(shì)。上述變化趨勢(shì)說(shuō)明衍生反應(yīng)時(shí)間與溫度之間存在著顯著的交互作用,不同的衍生反應(yīng)時(shí)間與溫度的組合,會(huì)導(dǎo)致回收率發(fā)生較大變化。從圖1可以看出,衍生反應(yīng)溫度相比反應(yīng)時(shí)間,對(duì)回收率有更強(qiáng)的影響。

      如圖5B所示,在衍生劑用量處于較低水平時(shí),回收率呈現(xiàn)較低水平,但仍隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),而在衍生劑用量處于較高水平的情況下,回收率顯現(xiàn)較高水平,并隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢(shì),上述變化趨勢(shì)說(shuō)明衍生反應(yīng)時(shí)間與衍生劑用量之間存在顯著的交互作用,不同水平的衍生反應(yīng)時(shí)間與衍生劑用量的組合,會(huì)導(dǎo)致不同的響應(yīng)值變化。

      如圖5C所示,在衍生反應(yīng)溫度處于較低水平時(shí),隨著衍生劑用量的增加回收率顯現(xiàn)急劇增加的趨勢(shì),而在反應(yīng)時(shí)間處于較高水平的情況下,隨著衍生劑用量的增加回收率仍顯現(xiàn)較大幅度的增加,上述變化趨勢(shì)說(shuō)明衍生反應(yīng)溫度與衍生劑用量之間不存在顯著的交互作用。

      3 討 論

      衍生反應(yīng)條件直接關(guān)系到仲丁胺的檢測(cè)效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法,考察了衍生反應(yīng)溫度、時(shí)間以及衍生劑用量對(duì)仲丁胺衍生效果的影響,優(yōu)化了衍生反應(yīng)條件。結(jié)果表明,多元二次回歸方程的模型回歸顯著,且失擬性檢驗(yàn)不顯著,說(shuō)明通過(guò)本試驗(yàn)所建立的二次回歸方程成功地反映了所考察的三個(gè)因素與響應(yīng)值之間的相關(guān)性。在仲丁胺衍生并測(cè)定過(guò)程中,衍生反應(yīng)時(shí)間、溫度及衍生劑用量都是影響仲丁胺回收率的關(guān)鍵因素,三個(gè)因素的影響順序?yàn)椋貉苌鷦┯昧浚狙苌鷾囟龋狙苌鷷r(shí)間。并且反應(yīng)時(shí)間與溫度、反應(yīng)時(shí)間與衍生劑用量的交互作用對(duì)回收率的影響極為顯著。各因素的最佳條件為:衍生時(shí)間31.72min、衍生溫度22.42℃、衍生劑用量1.25mL,理論回收率為112%。以衍生時(shí)間31.7min、衍生溫度22.4℃、衍生劑用量1.25mL,進(jìn)行衍生反應(yīng)試驗(yàn)得到平均回收率為(108±1.71)%,與軟件預(yù)測(cè)的回收率數(shù)值較為接近。

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      Optimization of Derivatization Conditions for Gas Chromatographic Determination of Sec-Butylamine by Response Surface Methodology

      JI Shu-juan,YU Lan-jie,LIU Ling,BAI Bing,ZHOU Dan

      (College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

      Derivatization reaction is very important for the determination of sec-butylamine. For the purpose of establishing a gas chromatography-electron capture detection (GC-ECD) method for determining sec-butylamine, the optimal derivatization reaction conditions were studied by response surface methodology. Based on the results of one-factor-at-a-time experiments, a central composite design was used to investigate the pairwise interaction effects of reaction time, temperature and derivatization reagent (acetonitrile containing 0.05μL/mL pentafluorobenzaldehyde) amount on sec-butylamine recovery. The optimal derivative temperature, derivative duration and derivatization reagent amount were found to be 22.42 ℃, 31.72 min and 1.25 mL, respectively.

      sec-butylamine;residue;derivatization;response surface methodology;gas chromatography

      TS207.3

      A

      1002-6630(2012)08-0211-05

      2011-06-27

      農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目(2130109)

      紀(jì)淑娟(1960—),女,教授,博士,主要從事食品質(zhì)量控制。E-mail:jsjsyau@sina.com

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