環(huán)丙沙星時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的建立與應(yīng)用

李麗華，白瑞櫻，孫遠(yuǎn)明，沈玉棟，徐振林，雷紅濤，張 挺，王 弘，楊金易,*

(1.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；

2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

環(huán)丙沙星時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的建立與應(yīng)用

李麗華1，白瑞櫻2，孫遠(yuǎn)明1，沈玉棟1，徐振林1，雷紅濤1，張 挺1，王 弘1，楊金易1,*

(1.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；

2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

建立基于時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)的環(huán)丙沙星(CPF)間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法。將環(huán)丙沙星-卵清白蛋白(CPFOVA)包被于固相微孔板，CPF標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中CPF與CPF包被原(CPF-OVA)共同競(jìng)爭(zhēng)限量的CPF抗體，用銪標(biāo)羊抗兔IgG示蹤，建立環(huán)丙沙星時(shí)間分辨熒光免疫分析方法(CPF-TRFIA)；考察包被質(zhì)量濃度、抗體稀釋液、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)方法靈敏度的影響。結(jié)果表明：在優(yōu)化條件下，該方法的檢測(cè)限為0.5μg/L，半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為4.32μg/L，線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為1.14～28.85μg/L；該方法對(duì)蜂蜜中CPF平均回收率為80.66%～100.30%，對(duì)牛奶中CPF的平均回收率為76.30%～95.22%，兩者的平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為7.42%和10.92%。CPF-TRFIA間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定環(huán)丙沙星具有靈敏度高、特異性好、性能穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，適于高通量篩查。

環(huán)丙沙星；時(shí)間分辨熒光免疫分析；抗體；添加回收

鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CPF)是第3代氟喹諾酮類(fluoroquinolones，F(xiàn)QNs)藥物，具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、副作用小及組織分布較好等特點(diǎn)[1]，主要用于治療傷寒、泌尿道感染、呼吸道感染、腸道感染，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類的多種感染性疾病的治療。其殘留不但對(duì)人體有直接的危害，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等的不良反應(yīng)，同時(shí)動(dòng)物性食品中較低濃度的環(huán)丙沙星殘留通過(guò)食物鏈向人類傳播，容易誘導(dǎo)人類致病菌對(duì)其耐藥性的增強(qiáng)，并導(dǎo)致周圍環(huán)境中耐藥性菌株的增加[2-3]。由于其耐藥性和潛在致癌性性，歐盟、日本及我國(guó)均對(duì)組織中環(huán)丙沙星的最高殘留限量進(jìn)行了限定。

目前檢測(cè)環(huán)丙沙星的主要方法有微生物法、儀器法和免疫分析法，其中微生物法[4-6]檢測(cè)限較高、不夠靈敏，且難以準(zhǔn)確定量[7]；儀器法主要包括液相色譜法(liquid chromatography，LC)、高效液相色譜法(high performance LC，HPLC)、高效毛細(xì)管電泳分析法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC mass spectrometer，LC-MS)[8-12]等。HPLC法由于測(cè)定靈敏度高、分離能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣，適用于藥物殘留的確認(rèn)，是目前儀器法中應(yīng)用最多的一種方法，但是其操作繁瑣、儀器昂貴、通量小限制了其進(jìn)一步發(fā)展；免疫分析法(imunosorbent assay，IA)目前應(yīng)用較廣泛的是酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked imunosorbent assay，ELISA)[13]，但該方法存在靈敏度有限、線性范圍較窄等缺點(diǎn)，近年來(lái)新的免疫分析方法發(fā)展很快，例如化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)、時(shí)間分辨免疫檢測(cè)等；時(shí)間分辨免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)采用鑭系金屬如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)等作為示蹤標(biāo)記物，不影響被標(biāo)記物的活性，且具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[14]，符合臨床診斷和科學(xué)研究的需要，其在醫(yī)學(xué)、食品分析、環(huán)境等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[15-17]，目前關(guān)于環(huán)丙沙星的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究目的是建立高靈敏度的CPF-TRFIA方法，應(yīng)用于環(huán)丙沙星殘留的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛血清白蛋白(BSA)、羊抗兔IgG 美國(guó)Sigma公司。

99.5%環(huán)丙沙星(CPF)、99.8%恩諾沙星(enrofloxacin，EN)、99.5%培氟沙星(pefloxacin，PE)、99.5%加替沙星(gatifloxacin，GA)、99.5%諾氟沙星(norfloxacin，NOR)、99.5%洛美沙星(lomefloxacin，LOM)、99.5%氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、99.5%沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、99.5%那氟沙星(nadifloxacin，NA)、99.5%可林沙星(clinafloxacin，CLI)標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；環(huán)丙沙星-卵清白蛋白偶聯(lián)物(CPF-OVA)、環(huán)丙沙星多克隆抗體(CPF-Ab)由本實(shí)驗(yàn)室提供；Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)、增強(qiáng)液廣州市豐華生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Wallac VITOR31420多標(biāo)記分析儀 美國(guó)PE公司；超低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司；UV-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；超純水器 美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制和銪標(biāo)羊抗兔IgG制備

試劑配制：環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取10.00mg環(huán)丙沙星溶于10mL超純水，配制成1mg/mL環(huán)丙沙星貯備液，使用前配成質(zhì)量濃度梯度為0、1、3、9、27、81μg/L的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品工作液；T液： 20mmol/L、pH7.85的Tris-HCl，含0.1% BSA、0.9% NaCl和0.05%NaN3；洗滌液： 50mmol/L、pH7.4的Tris-HCl，含0.05% Tween-20和0.04% NaN3；封閉液： 50mmol/L、pH7.4的PBS，含4%甘氨酸和0.1% BSA。

4g甘氨酸和0.1g BSA溶于100mL PBS中。

抗體制備：取溶解于50mmol/L PBS、pH7.4的10mg/mL羊抗兔IgG 0.1mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖鹽條件，洗脫液為50mmol/L、pH7.85 NaCO3-NaHCO3緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A280－0.74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗兔稀釋至5mg/mL。取200μL稀釋后的羊抗兔IgG加入含 0.5mg的Eu3+-DTTA的棕色小瓶中，置于28℃恒溫烘箱中反應(yīng)48h，反應(yīng)液用50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B(1cm×30cm)層析，測(cè)定每管的熒光計(jì)數(shù)值，檢測(cè)稀釋后的第一個(gè)計(jì)數(shù)峰，稀釋后備用。

1.2.2 檢測(cè)步驟

將CPF-OVA用100mmol/L NaCO3-NaHCO3溶液(pH9.6)包被液稀釋至需要濃度，96孔微孔板加100μL/孔，4℃放置過(guò)夜；棄去包被液，洗滌液洗2次，加200μL封閉液37℃封閉2h，棄去封閉液，于潔凈吸水紙上拍干；加50μL CPF參考標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到CPF-OVA板條中，加入50μL稀釋后的CPF-Ab；25℃振蕩反應(yīng)，洗滌液洗6次；加100μL稀釋過(guò)的銪標(biāo)羊抗兔，25℃振蕩反應(yīng)，洗滌液洗6次；加200μL增強(qiáng)液振蕩反應(yīng)5min，讀數(shù)。

1.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最佳包被質(zhì)量濃度的選擇

取96孔微孔板反應(yīng)條12條，用包被液將CPF-OVA作一系列稀釋，質(zhì)量濃度分別為200、100、75、50μg/L，每孔3個(gè)平行，進(jìn)行包被；抗體按照棋盤滴定篩選出來(lái)的質(zhì)量濃度稀釋，按照檢測(cè)步驟1.2.2節(jié)方法測(cè)定各稀釋度熒光計(jì)數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(CPF質(zhì)量濃度)為橫坐標(biāo)、各稀釋度熒光計(jì)數(shù)(B)與最高質(zhì)量濃度的熒光計(jì)數(shù)(B0)的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線靈敏度較高、斜率較大的抗原質(zhì)量濃度即為最適包被工作質(zhì)量濃度。

1.2.3.2 最適抗體稀釋液的確定

在包被最佳質(zhì)量濃度CPF-OVA板條，分別以PBS(pH7.4、100mmol/L)、PBST(pH7.4、100mmol/L)、Tris-HCl(pH7.85、50mmol/L)、T液4種溶液作為藥物稀釋液，以標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(CPF質(zhì)量濃度)為橫坐標(biāo)、各稀釋度熒光計(jì)數(shù)(B)與最高質(zhì)量濃度的熒光計(jì)數(shù)(B0)的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線靈敏度較高、斜率較大的抗原質(zhì)量濃度即為最適包被工作質(zhì)量濃度。

1.2.3.3 最適競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的確定

在包被好的板條中，分別加入系列質(zhì)量濃度的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品及抗體，分別反應(yīng)15、30、45、60min，以標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(CPF質(zhì)量濃度)為橫坐標(biāo)、各稀釋度熒光計(jì)數(shù)(B)與最高質(zhì)量濃度的熒光計(jì)數(shù)(B0)的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線靈敏度較高、斜率較大的抗原質(zhì)量濃度即為最適包被工作質(zhì)量濃度。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)優(yōu)化后的條件，建立定量檢測(cè)間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出該方法的線性檢測(cè)范圍(IC20～I(xiàn)C80)和 IC50。

1.2.4 方法學(xué)考核

1.2.4.1 靈敏度

作CPF質(zhì)量濃度為0的孔10個(gè)，計(jì)算10組零點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品熒光計(jì)數(shù)的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，以零劑量點(diǎn)熒光值(CPS)均值x－2s后的熒光計(jì)數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)質(zhì)量濃度為檢測(cè)限[18]。

IC50：即50%抑制率，由Origin 7.5軟件計(jì)算得出。

1.2.4.2 穩(wěn)定性[19]

比較計(jì)數(shù)質(zhì)量濃度0點(diǎn)計(jì)數(shù)的20%、50%、80%時(shí)的效應(yīng)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(ED20、ED50、ED80)，根據(jù)多次測(cè)定判斷劑量反應(yīng)曲線的位置漂移考核方法的穩(wěn)定性。同時(shí)采用加速實(shí)驗(yàn)考核長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性，將試劑盒于37℃孵育箱中6d后再檢測(cè)結(jié)合率、抑制率反應(yīng)曲線等各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4.3 特異性

將CPF與其同系物倍比稀釋，按照1.2.2節(jié)操作，計(jì)算同系物的交叉反應(yīng)率和各競(jìng)爭(zhēng)物IC50。

1.2.4.4 回收率

牛奶樣品的處理：分別稱取1g牛奶于2mL離心管中，添加0、10、50、100ng CPF于牛奶樣品中，靜置10min，10000r/min離心10min。用純水稀釋20倍后直接用于檢測(cè)。

蜂蜜樣品的處理：分別稱取2g蜂蜜于15mL離心管中，分別添加0、20、100、200ng CPF于蜂蜜樣品中，靜置10min，加4mL超純水、4mL乙酸乙酯，旋渦振蕩20min，4000r/min離心10min。取上清液，用氮?dú)獯蹈?。加?mL水和4mL正己烷，充分振蕩后，4000r/min離心5min，棄去上層，取50μL下層清液待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eu3+-羊抗兔抗體的理化和免疫學(xué)鑒定

Eu3+-標(biāo)記物經(jīng)Sepharose CL-6B層析，結(jié)果如圖1所示，收集第一個(gè)(8、9、10管)洗脫峰。以PE-Wallac提供的Eu3+-羊抗兔抗體第一洗脫峰的Eu3+含量為95.3μmol/L，蛋白含量為10.9μmol/L，即平均每個(gè)羊抗兔抗體分子分別連接了8.74個(gè)銪。

圖1 Eu3+-羊抗兔熒光和紫外檢測(cè)圖Fig.1 UV and fluorescence spectra of Eu3+-goat anti-rabbit IgG

2.2 最佳包被質(zhì)量濃度的確定

圖2 不同包被質(zhì)量濃度的TRFIA抑制曲線Fig.2 Indirect competitive CPF-TRFIA curves under various coating concentrations

不同包被質(zhì)量濃度得到的TRFIA抑制曲線如圖2所示。包被質(zhì)量濃度為100μg/L時(shí)曲線斜率較大，IC50值最低，靈敏度最高，且其零質(zhì)量濃度點(diǎn)熒光值范圍合理。因此選擇包被質(zhì)量濃度為100μg/L。

2.3 最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的確定

不同一抗反應(yīng)時(shí)間所得到的TRFIA抑制曲線如圖3所示，反應(yīng)時(shí)間在15min以上后熒光值趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)充分，且此時(shí)IC50值最低、靈敏度最高，且其零質(zhì)量濃度點(diǎn)熒光值范圍合理。故選擇反應(yīng)時(shí)間為15min。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間的TRFIA抑制曲線Fig.3 Indirect competitive CPF-TRFIA curves under various reaction times

2.4 最佳抗體稀釋液的選擇

在最佳包被條件和最佳反應(yīng)時(shí)間條件下，不同抗體稀釋液得到的TRFIA抑制曲線如圖4所示，T液作為抗體稀釋液時(shí)曲線斜率較大，零點(diǎn)較高，IC50值最低，靈敏度最高，且其熒光值范圍合理。因此選擇抗體稀釋液是T液。

圖4 不同抗體稀釋液的抑制曲線Fig.4 Indirect competitive CPF-TRFIA curves using various antibody dilutions

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖5 環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.5 Standard curve of indirect competitive CPF-TRFIA for ciprofloxacin

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度調(diào)整為0、1、3、9、27、81μg/L，曲線的線性良好，采用以上優(yōu)化好的包被質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、抗體稀釋液等，在最佳條件下，間接競(jìng)爭(zhēng)CPF-TRFIA的結(jié)果經(jīng)Origin 7.5軟件的Log-Logit函數(shù)處理所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示，該方法的線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為1.14～28.85μg/L，IC50值為4.32μg/L。

2.6 CPF- TRFIA方法的考核

2.6.1 方法的靈敏度和穩(wěn)定性

以零劑量點(diǎn)發(fā)光之均值減去2s后的發(fā)光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到響應(yīng)值為檢測(cè)的靈敏度，間接競(jìng)爭(zhēng)CPF-TRFIA的靈敏度為0.5μg/L。8條不同時(shí)間進(jìn)行的間接競(jìng)爭(zhēng)CPFTRFIA的效應(yīng)點(diǎn)均值ED80、ED50、ED20分別為(1.13±0.10)、(4.32 ±0.31)、(28.85 ±0.39)μg/L。說(shuō)明劑量反應(yīng)曲線的位置漂移小，方法的穩(wěn)定性好。同批量連續(xù)6個(gè)月應(yīng)用分析，發(fā)現(xiàn)劑量反應(yīng)曲線基本一致；試劑盒置于37℃孵育箱中6d后其0質(zhì)量濃度點(diǎn)的計(jì)數(shù)為4℃同時(shí)保存試劑的90%、取代比(B0/B100)在10左右，劑量反應(yīng)曲線與4℃保存的試劑結(jié)果相似。由于在加速實(shí)驗(yàn)中以1d代替1個(gè)月，所以其有效期應(yīng)在6個(gè)月以上。

2.6.2 方法的特異性

采用間接競(jìng)爭(zhēng)CPF-TRFIA檢測(cè)，將CPF標(biāo)準(zhǔn)品與其他喹諾酮類(FQNs)藥物均先稀釋至1mg/mL，然后用水作梯度稀釋，用CPF-Ab做間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA，結(jié)果見(jiàn)表1。由于氟喹諾酮類藥物含有共同的喹諾酮萘啶環(huán)，之間存在一定的交叉反應(yīng)，與恩諾沙星、培氟沙星、加替沙星、諾氟沙星之間的交叉反應(yīng)率分別為11.09%、13.43%、11.67%、11.04%(表1)。

表1 與其他喹諾酮類的交叉反應(yīng)性Table 1 Cross reactivity with other FQNs

2.6.3 方法的回收率

間接CPF-TRFIA在環(huán)丙沙星添加量為10、50、100ng/g 之間的批間和批內(nèi)變異分別為7.42%和10.92%，其應(yīng)用于牛奶和蜂蜜中的添加回收率如表2所示。

表2 間接CPF-TRFIA測(cè)定樣品中CPF的回收率(n＝5)Table 2 Recovery rates of ciprofloxacin from samples determined by indirect competitive CPF-TRFIA (n＝5)

3 討 論

隨著環(huán)丙沙星在動(dòng)物性食品中的廣泛應(yīng)用，其殘留問(wèn)題已引起廣泛的關(guān)注。環(huán)丙沙星殘留易造成人和動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)且具有潛在“三致”作用，并會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌殘生抗藥性[20]。其在動(dòng)物性食品中的殘留及耐藥性問(wèn)題已引起重視。歐盟規(guī)定：FQs在動(dòng)物雞肉、肝臟和腎臟中最大藥物殘留為30μg/kg(恩諾沙星和環(huán)丙沙星量之和)[9]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥殘留指定動(dòng)物性食品中最高殘留量為100～300μg/kg(恩諾沙星和環(huán)丙沙星量之和)[22]。日本規(guī)定對(duì)進(jìn)口鰻魚中的環(huán)丙沙星和恩諾沙星類的檢測(cè)限為 50μg/kg[23]。

高靈敏、大通量、快速檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防污染和中毒，并對(duì)動(dòng)物性食品進(jìn)行檢測(cè)是最有效的手段，因此開(kāi)展CPF等獸藥檢測(cè)方法的研究和應(yīng)用非常重要。GB/T 21312—2007《動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法：液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中用液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中環(huán)丙沙星的定量限為8ng/g[24]；Guo等[9]利用熒光檢測(cè)器檢測(cè)環(huán)丙沙星在鰻魚中的代謝規(guī)律。但這些方法需要的儀器昂貴、難攜帶等，難以應(yīng)用于大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在免疫分析方面較常用的是酶聯(lián)免疫分析法，Hu等[25]建立了檢測(cè)魚肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留的ELISA方法，該方法的IC50為245.86μg/L，在魚肉中的添加回收率在80.57%～94.61%之間，相對(duì)于TRFIA方法仍然存在靈敏度不夠高，線性范圍不夠?qū)挼热秉c(diǎn)。本研究建立的間接競(jìng)爭(zhēng)CPF-TRFIA，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，該方法的檢測(cè)限為0.5μg/L，IC50為4.32μg/L，線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為1.14～28.85μg/L。方法對(duì)蜂蜜中CPF平均回收率在80.66%～100.30%之間，對(duì)牛奶中CPF的平均回收率在76.30%～95.22%之間。批間和批內(nèi)變異分別為7.42%和10.92%。本方法可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求，并滿足其線性范圍相對(duì)較寬的要求，樣品處理簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)大批量樣品篩查，有推廣應(yīng)用前景。

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Development and Application of Time-resolved Fluroimmunoassay (TR-FIA) for Ciprofloxacin Determination

LI Li-hua1，BAI Rui-ying2，SUN Yuan-ming1，SHEN Yu-dong1，XU Zhen-lin1，LEI Hong-tao1，ZHANG Ting1，WANG Hong1，YANG Jin-yi1,*
(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science, South China Agricultural University,Guangzhou 510642, China；2. Department of Physiology and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences,Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, China)

A time-resolved fluroimmunoassay (TRFIA) for the determination of ciprofloxacin (CPF) in an indirect competitive immunoassay mode was developed and applied. CPF-OVA was coated by physical adsorption onto a microtitre plate, and CPF standard or sample was competed with CPF-OVA for limited anti-CPF antibody, which was traced using europium-labeled goat anti rabbit IgG. The effects of experimental conditions including CPF-OVA concentration, buffer type, and reaction time on the sensitivity of TRFIA were explored. Under optimal conditions, the method revealed a detection limit of 0.5 μg/L, an IC50 of 4.32μ g/L and a linear range (IC20－IC80) of 1.13－28.85 μg/L. The spike recovery rates of CPF in honey and milk at three spike levels were in the range of 80.66%－100.30% and 76.30%－95.22%, respectively, and the intra-batch and inter-batch coefficients of variation were 7.42% and 10.92%, respectively. The method was sensitive, specific, stable and suitable to be used for high-throughput determination of CPF residues.

ciprofloxacin；time-resolved fluroimmunoassay；antibody；recovery

S859；O625.6

A

1002-6630(2012)08-0216-05

2011-03-24

廣東省科技廳2010粵港招標(biāo)項(xiàng)目(2010A020104004)；廣東省-教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2010A090200084；2009B090300409)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003008-08)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(農(nóng)業(yè)攻關(guān)2009A020101004)

李麗華(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)。E-mail：lihua361@126.com

*通信作者：楊金易(1979—)，男，助理研究員，博士后，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：yjy361@163.com