朱雪梅，阮 霞，胡蔣寧，熊 華，鄧澤元，彭海龍

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330031)

松籽油脂肪酸組成及分布特征分析

朱雪梅，阮 霞，胡蔣寧*，熊 華，鄧澤元，彭海龍

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330031)

通過氣相色譜法分析了松仁油的總脂肪酸組成及其上位置分布特點。結(jié)果表明，松仁油主要含有亞油酸(46.29%)、油酸(26.68%)和松籽油酸(13.84%)。sn2位置上的亞油酸(66.84%)和油酸(28.33%)含量高于sn1，3上的含量，但是Δ5系列多不飽和脂肪酸(Δ5－PUFA)主要分布在sn1，3位置上。Δ5－PUFA的存在和它們選擇性地分布在sn1，3位等特點是包括紅松籽油在內(nèi)主要松屬植物果實油脂的特點。松籽油主要由12種甘油三酯組成，其中含量比較多的是LLPi(24.13%)，OLL/LOL(17.87%)和LOPi(14.32%)。我們還對植物甾醇和維生素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示松籽油含有141.64mg/100g的總植物甾醇和23.63mg/100g的總生育酚。

松仁油，脂肪酸組成，脂肪酸位置分布，甘油三酯，植物甾醇，生育酚

紅松(Pinus koraiensis)在世界很多地都有生長，主要產(chǎn)區(qū)在中國東北、河北、山東、朝鮮和韓國。紅松仁又名松仁、松子仁、海松子、羅松子、松果和松實等?！侗静菥V目》記載:“松子味甘，性溫，無毒。主治:骨頭節(jié)風(fēng)濕，頭眩，祛風(fēng)濕，潤五臟，充饑，逐風(fēng)痹寒氣，補體虛，滋潤皮膚，久服輕身不老，另有潤肺功能，治燥結(jié)咳嗽”［1］。紅松籽富含脂肪，其含量在60%以上。現(xiàn)在藥理實驗證明松籽油有抗肥胖、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗癌等功效［2－4］。然而國內(nèi)對于松油脂肪酸成分的分析數(shù)據(jù)存在很大差異。例如胡茲苓等人的研究表明松籽油中含有37.7%的亞油酸、25%的油酸和18.2%的松油酸［5］;而牛之瑞、李小強等分析得到大約46%的亞油酸、31%的油酸和15%的α－亞麻酸［6－7］。另外，國產(chǎn)松籽油的脂肪酸位置組成和甘油三酯的構(gòu)成并沒有人進(jìn)行報道。值得一提的是，除了總脂肪酸構(gòu)成以外，脂肪酸位置分布和甘油三酯的構(gòu)成也影響松籽油理化性質(zhì)甚至生物活性的其他因素［8］。本文從驗證國產(chǎn)松籽油脂肪酸組成的角度出發(fā)，對松籽油的成分組成進(jìn)行了詳細(xì)分析，其中包括總脂肪酸構(gòu)成、脂肪酸位置分布、甘油三酯組成及植物甾醇和生育酚的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Supelco 37脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品、松籽油酸脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品如 POL/OPL/ LOP、OLL/LOL、LLL、PLL/LPL、OOL/OLO、PPL/PLP和OOO等標(biāo)準(zhǔn)品、植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(β－谷甾醇，菜油甾醇等)、維生素E標(biāo)準(zhǔn)品(α－，γ－，和δ－生育酚)、胰脂肪酶、膽鹽、CaCl2、BF3(三氟化硼)甲醇溶液、膽固醇、BHT、焦棓酸等 Sigma公司;正己烷、異辛烷、異丙醇、乙醚、氯仿、乙腈 色譜純，Burdick Jackson公司;其他藥品試劑 均為分析純。

HP6890氣相色譜儀(GC)、安捷倫－1100高效液相色譜儀 Agilent，USA;FW100型高速萬能粉碎機(jī)北京科偉永興儀器有限公司;RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技儀器廠;DHG－9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 江西鼎技科學(xué)儀器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BS 224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;索氏提取器。

1.2 實驗方法

1.2.1 松籽油的提取 粉碎紅松仁，然后用溶有BHT(0.2mg BHT/g松籽)的正己烷在65℃下索氏提取2h，并重復(fù)三次提取，最后旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，將提取得到的油－20℃保存。

1.2.2 總的脂肪酸組成及位置組成分析 脂肪酸甲酯的制備:稱取25mg油樣，加入20μL 0.5mg/mL十七烷酸(C17∶0)甲酯的氯仿溶液為內(nèi)標(biāo)(IS)，加入1.5mL 0.5mol/L甲醇鈉，充分混合后在 95℃反應(yīng)3min，冷卻，再加入2mL BF3甲醇溶液(10%)繼續(xù)在95℃下反應(yīng)2min，冷卻至室溫后，加入1mL飽和氯化鈉和2mL異辛烷，提取脂肪酸甲酯經(jīng)過無水硫酸鈉干燥后用于氣相(GC)分析。

GC分析條件:氣相色譜儀(GC，HP6890)配有自動進(jìn)樣器和火焰離子化檢測器，色譜柱為石英毛細(xì)管柱(SP－2560，100m×0.25mm×0.2μm，Supelco，PA)。柱溫先保持100℃(5min)，采用程序升溫以4℃/min升至220℃保持20min。載氣為N2，總氣體流速為52mL/min，進(jìn)樣口和檢測器的溫度為250℃和260℃。

脂肪酸位置組成分析和定量［8］:取7mg油樣，加入7mL 1mol/L Tris－HCl緩沖溶液(pH 7.6)，1.75mL 0.05%的膽鹽，0.7mL 2.2%的CaCl2和7.0mg胰脂肪酶，37℃水浴加熱3min，劇烈振蕩后加入4mL乙醚提取得到水解產(chǎn)物，過無水硫酸鈉干燥后用氮氣濃縮。最后將得到的水解產(chǎn)物(全部)用硅膠60 F254薄層板分離水解產(chǎn)物，展開劑為正己烷－乙醚－乙酸(50∶50∶1，v/v/v)。刮下sn2位單酰甘油酯后用上述方法進(jìn)行甲酯化并用于氣相分析。sn1，3位的脂肪酸組成可表示為:sn1，3(%)=(3T－sn2)/2，其中T為總脂肪酸，sn2為sn2位上的脂肪酸。實驗重復(fù)操作2次。同總的脂肪酸一樣，以分單一脂肪酸甲酯的含量以其在分析得到總脂肪酸甲酯中面積比為定量單位，類似定量方法請參照文獻(xiàn)［8，10－11］。

1.2.3 甘油三酯種類的分析 各取5mg油樣溶解在15mL氯仿中，取20μL溶液過膜，利用反相高效液相色譜(RP－HPLC)分析其甘油三酯的種類。

HPLC分析條件:安捷倫－1100高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測器，色譜柱為 Nova－Pak C18柱(3.9mm×150mm，4.6μm，Milford，MA)，流動相由乙腈(A)和異丙醇/正己烷(B;2∶1，v/v)組成，流速為1mL/min，起始流動相為80%A和20%B，保持44min后，流動相比例變?yōu)?4%A和46%B 10min，然后變?yōu)?00%B并保持7min。

甘油三酯的種類由等價碳數(shù)判定，等價碳數(shù)(ECN)可表示為:ECN=CN(總碳數(shù))－2DB(雙鍵數(shù))。在RP－HPLC分析條件中，甘油三酯保留時間與等價碳數(shù)一致，即等價碳數(shù)少的甘油三酯保留時間短，反之亦然［9］。所有甘油三酯的定性除了根據(jù)等價碳數(shù)和已知的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品外，并且參考其他裸子植物油的甘油三酯的相關(guān)分析報道［9］。

1.2.4 植物甾醇含量的測定 準(zhǔn)確稱量25mg樣品，加入50μL 1mg/mL的5－膽固醇－正己烷溶液(5－膽固醇作為內(nèi)標(biāo))，再加入2mL的2mol KOH乙醇溶液，在90℃下皂化15min。取出后冰水冷卻，加入1mL蒸餾水然后加入1mL正己烷充分混合后提取上層，并重復(fù)提取2次。得到的上層液用Na2SO4脫水后再用氮氣吹干。得到的殘留物加入50μL TMS(三甲基硅)甲醇溶液在60℃下甲酯化30min，然后用氣相色譜進(jìn)行分析。分析條件完全參考Zhu等的方法［10］。

1.2.5 生育酚含量的測定 稱取1g油樣，加入5mL含有6%的焦棓酸乙醇溶液和1.25mL 60%的KOH溶液，在70℃下皂化30min。取出后用冰水冷卻至室溫后，加入5mL 2%的NaCl溶液，用含有0.05%的乙醚－乙酸乙酯混合液(85∶15;V/V)提取液重復(fù)提取三次。收集得到的上層液用Na2SO4脫水后再用氮氣吹干。得到的殘留物用正己烷充分溶解并進(jìn)行液相分析。所有的分析都重復(fù)3次。HPLC分析條件:安捷倫－1100高效液相色譜儀，紫外檢測波長設(shè)為295nm，色譜柱為LiChrosorb Diol柱(3mm×100mm，5μm Chromapack，Rartian，NJ)，流動相為含有0.1%醋酸的正己烷(流速為 1mL/min)，分析時間是30min。

2 結(jié)果與分析

2.1 總脂肪酸組成

圖1是松籽油的氣相色譜圖。如圖1所示，脂肪酸碳原子數(shù)越少出峰越早，碳原子數(shù)相同的但是有雙鍵的出現(xiàn)較遲，而且保留時間隨雙鍵數(shù)增加而延長，另外保留時間也受雙鍵位置的影響。其先后出峰的順序為C16∶0、C18∶0、Δ9－C18∶1、Δ11－C18∶1、Δ5，9－C18∶2、Δ9，12－C18∶2、C20∶0、Δ5，9，12－C18∶3、Δ11－C20∶1、Δ11，14－C20∶2、Δ5，11，14－C20∶3。由表1可見，松籽油中含量最高的是亞油酸，其次是油酸，前者含量為46.29%，后者為26.68%。本文中檢測到了Δ5系列多不飽和脂肪酸(Δ5－PUFA)，主要包括松籽油酸(Δ5，9，12－C18∶3;13.84%)，Δ5－十八碳二烯酸(Δ5，9－C18∶2;2.20%)，Δ5－二十碳三烯酸(Δ5，11，14－C20∶2;0.61%)。松籽油酸是通常所指的γ－亞麻酸(Δ6，9，12－C18∶3)的異構(gòu)體。本文結(jié)果與部分國內(nèi)報道不一致。其中牛之瑞、陳曉強和陳雅沒有檢測到Δ5－PUFA，但是分別檢測到了約15%的α－亞麻酸和約20%的γ－亞麻酸［6－7，12］;李林強和李建科檢測了華山松籽油的脂肪酸組成，在其氣相色譜圖中有一個峰的保留時間在亞油酸之后，其面積相對濃度大于棕櫚酸但小于油酸的峰沒有進(jìn)行定性［13］。但是我們的測量結(jié)果和Wolff RL報道的數(shù)據(jù)一致［11］，與胡茲苓測得的主要脂肪酸類型相似但是含量差異較大［5］。另外本文檢測的國內(nèi)松籽油脂肪酸的組成與韓國產(chǎn)松籽油相似［10］。國外大量研究結(jié)果表明，Δ5－PUFA是松屬植物果仁特征性脂肪酸，所以我們推測國內(nèi)沒有分析檢測到這類脂肪酸的主要原因是分析條件不理想和缺少Δ5－系列多不飽和脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品。此外，本文還檢測到其他的少量脂肪酸如棕櫚酸4.62%、硬脂酸2.24%、十八碳一烯酸(Δ11－C18∶1)0.81%、花生酸(C20∶0)0.37%、二十碳一烯酸(Δ11－C20∶1)1.28%、二十碳二烯酸(Δ11，14－C20∶2)1.28%，這些分析結(jié)果也與Wolff RL等人的結(jié)果相似［11］。

表1 松籽油脂肪酸組成及其在甘油三酯中的位置分布(面積%)Table 1 The fatty acid composition and their positional distributions in triacylglycerol of pine seed oil(area%)

圖1 松籽油脂肪酸組成的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of fatty acids in pine seed oil

2.2 脂肪酸的位置分布

表1還顯示出主要的不飽和脂肪酸如油酸亞油酸在甘油三酯中sn2上的含量高于其在sn1，3位置上的含量，這個結(jié)果和普遍的植物油的脂肪酸位置分布一致，即植物油中的不飽和脂肪酸優(yōu)先分布在sn2位置，而飽和脂肪酸選擇性分布在甘油三酯的sn1，3位置。此分布特征有利于不飽和脂肪酸的吸收利用，因為食入的甘油三酯在胰酶作用下水解成游離脂肪酸和sn2單甘油酯，而sn2單甘油酯被優(yōu)先吸收。但是值得一提的是，與其他不飽和脂肪酸相反，Δ5－PUFA選擇性地分布在sn1，3位置。例如松籽油中含有13.84%的松籽油酸，其中只有1.59%分布在sn2位置，而絕大部分即19.96%的松籽油酸分布在sn1，3位置。這些結(jié)果與其它報道一致［10－11］。我們這個分析再一次證明，松屬植物籽油中的Δ5系列多不飽和脂肪酸絕對性分布在甘油三酯上的sn1，3位置，這是松鼠植物籽油的又一特性。另外我們也可以推測，這個位置分布特征可能會影響Δ5－PUFA在人體內(nèi)的吸收利用，不利于其生物活性的發(fā)揮。

2.3 甘油三酯的組成

圖2是松籽油中甘油三酯的液相色譜圖。用反相液相色譜法分離甘油三酯的主要根據(jù)是等價碳數(shù)，即等價碳數(shù)少的甘油單酯保留時間短，等價碳數(shù)大的甘油三酯保留時間長(圖2)。表2列出了松子油中甘油三酯的種類及其各自含量。從表2可以看出，構(gòu)成松籽油甘油三酯的等價碳數(shù)比較小，其中80%以上的甘油三酯的等價碳數(shù)≤44，這個數(shù)據(jù)也說明松籽油的融點低。松籽油中的甘油三酯成分比較復(fù)雜，主要檢測出12種甘油三酯組成，其中LLPi (24.23%)的含量最高，其次是OLL/LOL(17.87%)，再次是LOPi/OLPi(14.32%)。

圖2 松籽油甘油三酯的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of triacylglycerols in pine seed oil

2.4 植物甾醇和維生素E的含量

植物甾醇有降低膽固醇吸收，進(jìn)而能降低心臟病的危險［14］。而維生素不僅是植物油脂中的天然抗氧化劑，而且有調(diào)節(jié)血脂代謝、增強機(jī)體免疫力、提高抗病能力和延緩衰老的作用，因此分析植物甾醇和生育酚的含量有重要意義［15－17］。表3顯示出，松籽油只含有β－谷甾醇和菜籽甾醇，含量分別是124.91、16.73mg/100g，而β－谷甾醇的含量幾乎是菜籽甾醇的8倍。松籽油含有23.63mg/100g的生育酚，其中只含有 α－和 γ－生育酚且含量分別為 15.01、8.62mg/100g。

表2 松籽油的甘油三酯組成(面積%)Table 2 The triacylglycerol species of pine seed oil(area%)

表3 松籽油中植物甾醇和生育酚的含量(mg/100g)Table 3 Contents of tocopherols and phytosterols in pine seed oil(mg/100g)

3 結(jié)論

最新國際報道表明，松籽油有抗肥胖、抑制食欲、降低膽固醇、降血脂和降血壓的作用。我國的松籽資源豐富，但是關(guān)于松籽油的性質(zhì)研究和產(chǎn)品開發(fā)等研究相對較少。國內(nèi)相關(guān)研究者關(guān)于松籽油脂肪酸組成的報道尚存在爭議。本實驗系統(tǒng)研究了松仁油中總脂肪酸組成，脂肪酸位置分布，甘油三酯的組成以及植物甾醇和生育酚的含量。

通過氣相色譜法，我們分析驗證了國產(chǎn)松籽油中含有相對稀有的Δ5－PUFA(17.10%)，含有Δ5－PUFA是裸子植物種子油的一個組成特征［11］。其中松籽油酸(Pi，γ－亞麻酸的同位異構(gòu)體)的含量是13.84%，未能檢測出部分國內(nèi)研究者報道的α－亞麻酸或γ－亞麻酸［6－7］，這一檢測結(jié)果與國外相關(guān)報道相符［10－11］。另外，我們通過豬胰酶水解松籽油的方法，檢測了松籽油中脂肪酸在甘油三酯上的位置分布，特別值得一提的是，在總松籽油酸(13.84%)中，僅有1.59%分布在sn2位置，而19.95%分布在sn1，3位置，松籽油酸的這個分布特點與植物油中的不飽和脂肪酸不同，是包括松屬在內(nèi)裸子植物種子油成分組成的又一特點。

松籽油主要由12種甘油三酯組成，其中含量比較多的是LLPi(24.13%)，OLL/LOL(17.87%)和LOPi/OLPi(14.32%)。我們還對植物甾醇和維生素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示松籽油含有141.64mg/100g的總植物甾醇和23.63mg/100g的總生育酚。本文的研究可以為開發(fā)松仁油在功能食品與保健用油等應(yīng)用方面提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

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Characteristics of positional fatty acid composition and distribution in Pinus koraiensis seed oil

ZHU Xue－mei，RUAN Xia，HU Jiang－ning*，XIONG Hua，DENG Ze－yuan，PENG Hai－long
(School of Life Science and Food Engineering，State Key Lab of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330031，China)

The total and positional fatty acid composition were analyzed by GC.Linoleic(46.29%)，oleic(26.68%)，and pinolenic acid(13.84%)were the major fatty acids in pine seed oil.More linoleic(66.84%)and oleic acid (28.33%)were detected at sn2 than that at sn1，3 positions，while the most Δ5－polyunsaturated fatty acids (Δ5－PUFA)were preferentially located at sn1，3 positions.The presence of Δ5－PUFA and their positional distribution were the characteristics of the seed oils of pinus plant.Pine seed oil was composed by various of triacylglycerols，and LLPi(24.13%)，OLL/LOL(17.87%)and LOPi(14.32%)were the most abundant.Besides，141.64mg/100g of total phytosterol，and 23.63mg/100g of total tocopherols were also detected.

pine seed oil;fatty acid composition;positional fatty acid distribution;triacylglycerol;phytosterol; tocopherol

TS227

A

1002－0306(2012)10－0065－04

2011－09－01 *通訊聯(lián)系人

朱雪梅(1982－)，女，博士，講師，主要從事功能性油脂和天然產(chǎn)物方面的研究。

教育部博士點基金(20103601120004);江西省科技廳油脂加工與質(zhì)量控制重點資助項目(贛科發(fā)2010J217);國家自然科學(xué)基金(31071561)。