董汝晶，譙順彬，田 輝，張義明，羅 芳，陶希芹

(1.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550003; 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550003; 3.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，貴州貴陽550008)

藻類光生物反應(yīng)器的設(shè)計及應(yīng)用研究

董汝晶1，2，3，譙順彬3，*，田 輝1，2，張義明2，3，羅 芳3，陶希芹3

(1.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550003; 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550003; 3.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，貴州貴陽550008)

根據(jù)藻類的生長特點設(shè)計了一個容積為10.0L的光生物反應(yīng)器，其長×寬×高分別為320mm×80mm× 390mm。利用該反應(yīng)器進行螺旋藻培養(yǎng)實驗，采用響應(yīng)面法對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化研究，建立以藻體干重為響應(yīng)值，以光照強度、通氣量、培養(yǎng)時間和裝液量為自變量的二次多項式數(shù)學模型。培養(yǎng)條件優(yōu)化后螺旋藻最終干重為1.298g/L。實驗結(jié)果表明，所設(shè)計的反應(yīng)器能很好地滿足藻類生長，其培養(yǎng)產(chǎn)率也明顯提高。

光生物反應(yīng)器，螺旋藻，響應(yīng)面法，藻體干重

1 10.0L光生物反應(yīng)器的設(shè)計

1.1 反應(yīng)器的主體尺寸

反應(yīng)器容積為10.0L，采用氣升式作為循環(huán)動力。為了減少占地、提高空間利用率，將反應(yīng)器形狀設(shè)計為垂直板式，由主體結(jié)構(gòu)、光照系統(tǒng)和氣體循環(huán)系統(tǒng)三部分組成。主體結(jié)構(gòu)要求長、寬、高有合理的尺寸，其具體尺寸應(yīng)該以易于放大和方便操作為設(shè)計依據(jù)。增加高度可以減小占地面積，但同時也增加了培養(yǎng)液中的溶氧濃度，使氣液間氧的傳質(zhì)過剩，造成溶氧的過飽和，此外，需要消耗更大的氣流作為循環(huán)動力，使操作維護更加復(fù)雜。增加寬度能降低高度，可又增加了占地面積，同時隨著培養(yǎng)液濃度的不斷提高，光照強度衰減越明顯，減少了光能的利用率［4－5］。根據(jù)上述設(shè)計思想，本研究設(shè)計的反應(yīng)器主要技術(shù)參數(shù)見表1。

表1 10.0L氣升式生物反應(yīng)器的主要技術(shù)參數(shù)Table 1 The major parameters of 10.0L air lift photo－bioreactor

1.2 反應(yīng)器的光照系統(tǒng)

藻類的光合作用離不開光能，無論實驗室研究還是室外大規(guī)模養(yǎng)殖，光照都是其主要的限制因子之一。螺旋藻是研究和應(yīng)用比較廣泛的藻類之一，其最適光照強度到目前為止還沒有得到一致的認可［6－7］。但當光照強度低于2.0klx時，藻體生長緩慢甚至停止生長，而光照強度超過120klx時會使藻體受到傷害甚至死亡。除光照強度外，不同顏色的光質(zhì)對藻體的生長、光合放氧以及胞內(nèi)物質(zhì)的含量也有影響［8］。在常用的5種顏色即紅、黃、綠、藍和白色的光質(zhì)中，光照強度較大時處于紅光下生長最好，白光次之，綠光最差。綠光更有利于蛋白質(zhì)的積累，白光次之，紅光最差;藍光有利于氧的釋放，白光和紅光次之，黃光和綠光較低。此外，在藻體培養(yǎng)的過程中，關(guān)于光照周期也存在差異。殷春濤等［9］以鈍頂螺旋藻進行了光周期實驗對比，結(jié)果證明螺旋藻無光暗周期，處于黑暗階段時藻體完全停止生長;李樂農(nóng)等［10］以鈍頂螺旋藻為研究對象，每天光照時間分別為10、14和18h三個時間段，結(jié)果證明以光暗比為14∶10時對藻體生長、蛋白質(zhì)和葉綠素積累都是最好的。

在本反應(yīng)器中，使用數(shù)支12W的白色光質(zhì)日光燈作為光源，以對稱平行的方式布置在反應(yīng)器兩側(cè)，燈管與反應(yīng)器壁以及燈管之間的距離可根據(jù)要求進行調(diào)節(jié)，24h不間斷連續(xù)光照，通過控制燈管數(shù)目來滿足適合藻體生長的光照強度，采用照度計LUX－101直接測定，單位klx(千勒克司)。

1.3 反應(yīng)器的氣體循環(huán)系統(tǒng)

在藻類培養(yǎng)過程中，要求整個培養(yǎng)體系循環(huán)均勻，尤其要防止死角的形成，故在本反應(yīng)器中，氣體分布裝置布置在距反應(yīng)器底部以上1.0cm處的地方，采用向下通氣的方式以防止器壁出現(xiàn)死角，使培養(yǎng)液得到充分混合，且整個培養(yǎng)體系形成一個外循環(huán)系統(tǒng)。

氣體分布裝置孔徑大小直接關(guān)系到氣泡的大小，大氣泡的提升效果優(yōu)于小氣泡，且不利于氧的傳遞，但氣泡上升到液面時由于突然爆裂而產(chǎn)生強大的剪切力，對藻類破壞較大，使藻體細胞斷裂，甚至死亡，這種現(xiàn)象在培養(yǎng)螺旋藻時更加明顯;氣泡過小時又會提高氣液間氧的傳遞，增加培養(yǎng)液中的溶氧。本反應(yīng)器中設(shè)計氣體分布裝置時，在前期的實驗基礎(chǔ)上(孔徑大于3.0mm時通氣效果極差)，孔徑選取1.0mm左右為宜，能將氣流分散成直徑約2.0mm小氣泡，小氣泡在培養(yǎng)液表面破裂時產(chǎn)生的剪切力不致過度破壞藻體細胞。用氣泵和流量計控制通氣量和培養(yǎng)液的循環(huán)速度。

1.4 其它結(jié)構(gòu)

除上述幾個主要系統(tǒng)外，還為反應(yīng)器布置了溫控系統(tǒng)，用加熱裝置和溫控裝置可以快速加熱和準確的控制培養(yǎng)溫度，以滿足藻類生長需要。反應(yīng)器的主體采用玻璃制成，培養(yǎng)前可高溫滅菌。圖1是本實驗設(shè)計的一組(4套)反應(yīng)器，該反應(yīng)器具有操作簡便、結(jié)構(gòu)簡單、價廉實用等優(yōu)點。

圖1 系列光生物反應(yīng)器的俯視圖和主視圖Fig.1 The planform and front view of a series vertical plate photo－bioreactor

2 螺旋藻培養(yǎng)實驗

為了驗證所設(shè)計的反應(yīng)器是否適合藻體生長，實驗以該反應(yīng)器作為培養(yǎng)裝置培養(yǎng)鈍頂螺旋藻。

2.1 實驗材料

實驗藻種 鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis) fachb－130，由武漢水生生物研究所提供;培養(yǎng)基 采用Zarrouk培養(yǎng)基作為實驗培養(yǎng)基［6］。

2.2 實驗方法

實驗在溫度和pH一定的條件下(溫度維持在(30±1)℃、pH維持在(9.50±0.01)，考察光照強度、通氣量、培養(yǎng)時間和裝液量對藻體生長的影響，藻體干重(DW)的大小可表示藻體生長的情況。在未滅菌的情況下，新鮮藻泥按0.1g/L的量接入反應(yīng)器中進行培養(yǎng)(前期實驗表明以0.1g/L接入藻泥時平均比生長速率最大)。實驗以藻體干重為實驗指標，研究光照強度、通氣量、培養(yǎng)時間和裝液量對藻體生長的影響，實驗設(shè)計由Design Expert(Version 7.0.2，Stat－Ease Inc;Minneapolis，MN.USA)軟件設(shè)計，選取響應(yīng)面法對上述四個因子的最佳水平范圍進行優(yōu)化。各因子實驗水平編碼分別為－α，－1，0，1，α，見表2。在整個培養(yǎng)過程中定時補加溫度相同的無菌水使培養(yǎng)體積保持恒定，減少測定誤差。

表2 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗因子水平及編碼表自變量水平編碼Table 2 Level and code variables for CCD

2.3 藻體生物量的測定

采用干重法(DW)［11］:取培養(yǎng)液20mL于已烘干至恒重的紙片抽濾，蒸餾水沖洗兩次，85℃烘干至恒重，用精密電子天平稱量，去除對照即得。

表4 DW二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model DW

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 藻體干重二次多元模型的建立和顯著性檢驗

根據(jù)水平表2，驗證實驗包括4個因子，5個水平和6個中心重復(fù)，共30組實驗，其結(jié)果見表3。

表3 中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計及實驗結(jié)果Table 3 CCD matrix of the variables and the actual and predicted values of DW

利用Design Expert對實驗結(jié)果進行逐步回歸分析，并建立以藻體干重為響應(yīng)值的多元回歸模型，如下式所示:

Y=1.25+0.096A+0.0048B+0.039C－0.0098D +0.000313AB－0.018AC+0.0017AD+0.000063BC+ 0.00056BD+0.000438CD－0.1A2－0.057B2－0.024C2－0.033D2

其中，藻體干重為預(yù)測值，A、B、C、D分別為光照強度、通氣量、培養(yǎng)時間和裝液量的編碼值。

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表4。其中F＞F0.01(14，15)=3.56，P＜0.0001，說明該模型概率在α =0.01水平上差異顯著，模型復(fù)相關(guān)系數(shù) R2= 0.9851，說明藻體干重的實驗值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度;其校正決定系數(shù)R2Adj=0.9712，表明有約3.0%的藻體干重總量變異不能由該模型進行解釋。利用mathematica對上式求導(dǎo)，可知當光照強度、通氣量、培養(yǎng)時間和裝液量分別取最佳水平4.4klx、212.2L/h、8.8d和7.2L時，藻體干重最大預(yù)測值為1.277g/L。回歸分析結(jié)果還顯示，4個因子對藻體生長的影響大小依次為光照強度＞培養(yǎng)時間＞裝液量＞通氣量，光照強度和培養(yǎng)時間的影響非常顯著(P＜0.0001)，而通氣量對藻體生長影響較小;只有光照強度和培養(yǎng)時間對藻體干重的交互作用顯著(P＜0.0001)，而其它兩兩交互作用皆不顯著。

2.4.2 藻體干重模型驗證 為了驗證所建立的藻體干重模型是否具有實際意義，在優(yōu)化的因子水平范圍內(nèi)選擇性地進行了4組實驗，各因子水平見表5。

表5 模型驗證Table 5 Model validation experiments

利用 SPSS11.5(Statistical Package for Social Sciences，SPSS)軟件對表中數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析得知，藻體干重實際值與預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R2=0.954，證明該模型具有一定的實際指導(dǎo)意義。

2.4.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化后藻體的生長情況 培養(yǎng)條件優(yōu)化后，即光照強度、裝液量和通氣量取最佳水平時，將培養(yǎng)時間延長至14d，每天定時取樣測藻體干重，同時測定培養(yǎng)液的pH，以藻體干重和pH對培養(yǎng)時間作圖，如圖2所示。

從圖2可以看出，當培養(yǎng)液pH超過10.17后藻體生長達到平衡，且藻體干重達到1.298g/L。

3 結(jié)論

采用光合自養(yǎng)法培養(yǎng)螺旋藻對所設(shè)計的反應(yīng)器進行實驗驗證，并首次利用響應(yīng)面法對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。實驗選取影響藻體生長的4個因子(即光照強度、培養(yǎng)時間、裝液量和通氣量)為研究對象，對其最佳水平范圍進行了優(yōu)化，并建立以藻體干重為響應(yīng)值的二次多項式數(shù)學模型，當上述因子取最佳水平時，藻體干重最大預(yù)測值為1.277g/L。驗證實驗結(jié)果表明，本實驗所設(shè)計的反應(yīng)器能很好地滿足螺旋藻的生長，提高螺旋藻培養(yǎng)產(chǎn)率。同時，該反應(yīng)器具有價格低廉、結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便等優(yōu)點。同時，響應(yīng)面法優(yōu)化藻體培養(yǎng)條件過程新穎、科學，所建立的模型具有較好的實際指導(dǎo)意義。

圖2 培養(yǎng)條件優(yōu)化后螺旋藻的生長曲線培養(yǎng)液的pH變化曲線Fig.2 The growth curve of DW and the variation of pH after optimization cultivation condition

［1］Hu Q，Guterman H，Richmond A.A flat inclined modular photobioreactor for outdoor mass cultivation of photoautotroph［J］.Biotechnol.Bioeng，1996，51:51－60.

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Design of photo－bioreactor and the application for cultivating algae

DONG Ru－jing1，2，3，QIAO Shun－bin3，*，TIAN Hui1，2，ZHANG Yi－ming2，3，LUO Fang3，TAO Xi－qin3
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering of Guizhou University，Guiyang 550003，China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550003，China; 3.Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008，China)

A new photo－bioreactor was designed basing on the growth trait of the algae.The volume of the reactor was 10.0L，the length，width and height was 320，80，390mm，respectively.Used the reactor to culture Spirulina platensis，and employed the response surface methodology to optimize the fermentation conditions.Then，researched the optimization concentration levels and the relations between these factors and building up a quadratic regression equation with dry weight as the dependent，light intensity，air flow，time of cultivation and volume of medium as independent.Under the optimistically conditions，the final dry weight was 1.298g/L.According to the experiment results，the photo－bioreactor designed was fit to cultivate the algae.

photo－bioreactor;Spirulina platensis;response surface methodology;dry weight

TS206

A

1002－0306(2012)10－0306－04

光生物反應(yīng)器(photo bioreactor)是專門用于光合生物或具有光合能力的組織培養(yǎng)的一類裝置，除具有普通生物反應(yīng)器的基本結(jié)構(gòu)外，還具有光照系統(tǒng)。一般植物的光能利用率約為0.2%左右，而設(shè)計合理的光生物反應(yīng)器的光能利用率可達到18.0%，較高的光能利用率有利于促進光合生物的生長，提高其培養(yǎng)產(chǎn)率，但光照過強會導(dǎo)致光合生物生長停止，甚至死亡，造成培養(yǎng)損失［1－2］。藻類是生長最快的光合生物［3］，培養(yǎng)時通常采用氣升式光生物反應(yīng)器，這種反應(yīng)器用氣流提供循環(huán)動力，能避免產(chǎn)生強大的剪切力而破壞光合生物細胞。藻類進行光合作用會放出氧氣，當培養(yǎng)液中溶解氧過飽和時，抑制藻類的光合作用，不利于藻體的生長。因此，溶解氧的消除也是藻類培養(yǎng)時必須考慮的重要因素。本研究從降低螺旋藻生產(chǎn)成本的角度出發(fā)，旨在設(shè)計一套不但適合于螺旋藻開放式培養(yǎng)，而且兼具價格低廉、結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便的氣升式光生物反應(yīng)器。在此基礎(chǔ)上，采用光合自養(yǎng)法培養(yǎng)螺旋藻對所設(shè)計的反應(yīng)器進行實驗驗證，并利用響應(yīng)面法對其培養(yǎng)條件最佳水平范圍進行優(yōu)化研究。

2011－09－22 *通訊聯(lián)系人

董汝晶(1981－)，女，碩士，講師，研究方向:應(yīng)用微生物。

貴州省科學技術(shù)基金項目(黔科合J字【2010】2068號);國家自然科學基金項目(30460039)。