程 偉，高金燕，李 欣，劉法輝，陳紅兵

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047; 2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047; 3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330047; 4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047)

多酚氧化酶交聯(lián)β-酪蛋白的抗原性變化初步研究

程 偉1，2，3，高金燕1，4，李 欣1，4，劉法輝1，4，陳紅兵1，2，*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047; 2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047; 3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330047; 4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047)

利用多酚氧化酶催化牛乳β－酪蛋白交聯(lián)，并通過ELISA方法檢測(cè)交聯(lián)前后β－酪蛋白抗原性的變化。SDS－PAGE結(jié)果顯示，多酚氧化酶可以有效地催化β－酪蛋白交聯(lián)。同時(shí)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)的β－酪蛋白交聯(lián)后的半抑制濃度(IC50值)由2.63μg/mL變?yōu)?.07μg/mL，表明交聯(lián)后β－酪蛋白抗原性明顯降低。本研究工作為通過多酚氧化酶交聯(lián)制備低致敏性乳制品提供了部分理論依據(jù)。

多酚氧化酶，酶交聯(lián)，β－酪蛋白，牛奶過敏

酶交聯(lián)蛋白技術(shù)是食品非熱加工中的一種新方法，它是利用酶催化蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使蛋白質(zhì)內(nèi)部多肽鏈之間(分子內(nèi)交聯(lián))或蛋白質(zhì)之間(分子間交聯(lián))形成共價(jià)鍵，改變其原有的空間結(jié)構(gòu)，從而改善蛋白質(zhì)的乳化性、起泡性等一系列功能特性［1］。已報(bào)道用于催化蛋白質(zhì)交聯(lián)的酶有轉(zhuǎn)谷酰胺酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等［2］。其中，多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO;EC 1.14.18.1)，通常也稱為酪氨酸酶，是由核編碼的含銅金屬酶，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物中，是果蔬等農(nóng)產(chǎn)品發(fā)生酶促褐變的主要原因［3］，這也是人們?cè)缙趯?duì)其功能的認(rèn)識(shí)。新近的一些研究表明，多酚氧化酶也能夠催化乳蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)［4］。目前，酶交聯(lián)乳蛋白的研究主要集中于改善其乳化性、起泡性等功能性［5］，而對(duì)交聯(lián)后乳蛋白的抗原性變化研究報(bào)道較少，且國內(nèi)未見關(guān)于PPO交聯(lián)牛乳蛋白后其抗原性變化的相關(guān)報(bào)道。本研究采用雙孢蘑菇多酚氧化酶催化牛乳中主要過敏原β－酪蛋白(β－Casein，β－CN)進(jìn)行交聯(lián)，并分析交聯(lián)后β－酪蛋白抗原性的變化，旨在利用交聯(lián)技術(shù)降低牛乳過敏原蛋白質(zhì)的抗原性，為利用酶交聯(lián)技術(shù)制備低致敏性乳制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

雙孢蘑菇 市售;β－酪蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制;咖啡酸、羊抗兔IgG:HRP酶標(biāo)二抗、OPD底物 美國Sigma公司;96孔可拆酶標(biāo)板 深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司;鄰苯二酚、丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等常規(guī)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司;Model 860酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio－Rad公司;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPO酶液制備 取市售的新鮮雙孢蘑菇去皮、切碎，放入研缽中，加入液氮，迅速用研缽研磨至無明顯顆粒的粉末狀。加入預(yù)冷丙酮(－20℃)，用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，將得到的粉末經(jīng)真空冷凍干燥后，即得多酚氧化酶粗酶粉，－20℃保存?zhèn)溆?。取多酚氧化酶丙酮?.5g，加入4℃預(yù)冷的50mL磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L、pH 7.0)，磁力攪拌30min，4000×g離心20min，取上清液即為多酚氧化酶酶液［6］。

1.2.2 PPO酶活測(cè)定 參照Gawlik－Dziki［7］等的方法，用磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L、pH 7.0)配制0.04mol/L鄰苯二酚溶液。測(cè)酶活時(shí)，取2.8mL鄰苯二酚溶液作為反應(yīng)底物，加入0.2mL粗酶液，混勻后在420nm波長(zhǎng)處比色，從酶液加入后開始計(jì)時(shí)，每30s記錄1次OD420nm值，以最初直線段的斜率計(jì)算酶比活力。一個(gè)酶活力單位定義為在測(cè)定條件下，每分鐘引起光密度值改變0.001所需的酶量。

1.2.3 抗β－酪蛋白多克隆抗體的制備 按照常規(guī)免疫方法［8］，利用本實(shí)驗(yàn)室分離得到的β－酪蛋白免疫日本大耳兔，制備抗β－酪蛋白多克隆抗體。選取2只 8周齡大的雄性日本大白耳兔(體重 1.8～2.0kg)，編號(hào)為A、B，所選日本大白耳兔喂養(yǎng)的食物中確保不含牛乳蛋白。喂養(yǎng)一周無異常后，開始免疫。免疫前，耳靜脈采血作為陰性血清。

β－酪蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化后皮下多點(diǎn)注射日本長(zhǎng)耳大白兔，免疫劑量為1mg/只。等量的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后每隔兩周加強(qiáng)免疫，并用間接ELISA法檢測(cè)兔血清的效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)升高并平穩(wěn)后即動(dòng)脈取血獲得多克隆抗體。

1.2.4 PPO酶促交聯(lián)β－酪蛋白方案 β－酪蛋白用磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L、pH 7.0)稀釋至1.0mg/mL，加入100mmol/L咖啡酸并使其終濃度為1mmol/L，然后繼續(xù)加入PPO粗酶液，并使反應(yīng)體系中多酚氧化酶濃度達(dá)到1.000U/mL，最后補(bǔ)充蒸餾水使β－酪蛋白溶液終質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，混勻，30℃反應(yīng)6h后，放入－20℃保存。同時(shí)設(shè)空白組和對(duì)照組，空白組為0.5mg/mL的β－酪蛋白，對(duì)照組為用滅活的酶(滅活條件:90℃，10min)代替反應(yīng)體系中的多酚氧化酶。

實(shí)驗(yàn)得到的交聯(lián)產(chǎn)物，按照Laemmli［9］的方法，進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)，根據(jù)蛋白條帶的變化分析并觀察β－酪蛋白的交聯(lián)情況。

1.2.5 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)交聯(lián)前后β－酪蛋白的抗原性 采用間接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法［10－11］，檢測(cè)PPO交聯(lián)β－酪蛋白后的抗原性變化。實(shí)驗(yàn)步驟如下。

1.2.5.1 抗原包被 用包被液稀釋?duì)拢业鞍字翝舛葹?.25μg/mL，100μL/孔加入酶標(biāo)板A中，4℃過夜。

1.2.5.2 洗滌 次日傾去孔內(nèi)的液體，用250μL/孔PBST(含0.05%吐溫－20的磷酸鹽緩沖液，10mmol/L，pH 7.4)溶液洗板3次，甩干。

1.2.5.3 封阻 酶標(biāo)板A中加入3%的明膠進(jìn)行封阻，每孔250μL，37℃放置1h。

1.2.5.4 板外競(jìng)爭(zhēng) 另取一塊新的酶標(biāo)板B，先用3%的明膠封阻1h后，洗滌，然后分別加入不同稀釋濃度的競(jìng)爭(zhēng)蛋白(β－酪蛋白和交聯(lián)蛋白)，再加入等體積的一抗，37℃孵育1h。

1.2.5.5 加樣 酶標(biāo)板A封阻結(jié)束后，從酶標(biāo)板B孔中吸取競(jìng)爭(zhēng)蛋白與一抗的混合物以100μL/孔的量對(duì)應(yīng)加入酶標(biāo)板A孔內(nèi)，于37℃孵育1h。

1.2.5.6 加酶標(biāo)二抗 用PBS將羊抗兔IgG:HRP酶標(biāo)二抗稀釋，加入100μL/孔，37℃孵育1h。

1.2.5.7 顯色 加新鮮配制的OPD底物溶液100μL/孔，37℃暗處反應(yīng)15min。

1.2.5.8 終止反應(yīng) 加 50μL/孔終止液(2mol/L H2SO4)中止反應(yīng)。

1.2.5.9 比色 用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm下測(cè)定各孔的吸光值。

根據(jù)得到的OD值，將各濃度的2種競(jìng)爭(zhēng)蛋白(β－CN和β－CN交聯(lián)蛋白)對(duì)應(yīng)的OD值轉(zhuǎn)換成結(jié)合率(B/B0)的%值，無競(jìng)爭(zhēng)蛋白時(shí)的OD值為B0，各濃度的競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的 OD值為 B。然后，以(B/B0)的%值為縱坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)蛋白濃度的對(duì)數(shù)值—lg［競(jìng)爭(zhēng)蛋白］為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出IC50值，比較β－CN和β－CN交聯(lián)蛋白的IC50值，并確定其抗原性變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚氧化酶性狀

實(shí)驗(yàn)制備得到的多酚氧化酶酶液成透亮的棕色液體，測(cè)得酶活為6300U/mL。

2.2 抗牛乳β－酪蛋白兔血清效價(jià)

用間接ELISA法測(cè)得兔血清效價(jià)，結(jié)果如圖1所示，至免疫第9周，兔血清效價(jià)不再升高，即動(dòng)脈取血獲得多克隆抗體。最終測(cè)定A兔血清效價(jià)為1∶240000，B兔為1∶150000。選用A兔血清用于后續(xù)抗原性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

2.3 交聯(lián)蛋白的SDS－PAGE圖譜分析

β－酪蛋白交聯(lián)后的 SDS－PAGE圖譜如圖2所示。

根據(jù)圖2可以看出，多酚氧化酶催化交聯(lián)β－酪蛋白后，原有低分子量β－酪蛋白幾乎完全消失，轉(zhuǎn)而生成了大量高分子量的交聯(lián)蛋白?？梢姡诒緦?shí)驗(yàn)條件下，多酚氧化酶主要催化β－酪蛋白分子間的交聯(lián)反應(yīng)，β－酪蛋白通過分子間交聯(lián)生成了多聚體，隨著β－酪蛋白多聚物的形成，其蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)會(huì)有所改變，可以推測(cè)它的抗原性也會(huì)隨之受到影響。

圖1 兔對(duì)牛乳β－酪蛋白的免疫應(yīng)答(抗血清效價(jià)的變化)Fig.1 Immune response of the rabbits against β－casein(Antiserum change defined by ELISA)

圖2 PPO對(duì)β－酪蛋白的交聯(lián)效果Fig.2 Effect of PPO on the cross linking of β－casein

2.4 多酚氧化酶交聯(lián)β－酪蛋白后的抗原性變化

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)β－酪蛋白交聯(lián)前后的抗原性結(jié)果如表1所示。

表1 β－CN與β－CN交聯(lián)蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果Table 1 Results of indirect competitive ELISA for β－CN and β－CN cross－linked protein

根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve by indirect competitive ELISA

在間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線中，當(dāng)結(jié)合率(B/B0)%為50%時(shí)，則其抑制率也為50%，此時(shí)所對(duì)應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)抗原的濃度就為半抑制濃度，也稱IC50值。在抗原抗體反應(yīng)中，IC50的數(shù)值越大，表明達(dá)到半抑制率所需的競(jìng)爭(zhēng)抗原量越多，也就是競(jìng)爭(zhēng)抗原與特異性IgG的結(jié)合能力越弱，即抗原性越弱。從本實(shí)驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出，β－CN的IC50值為2.63μg/ mL，β－CN交聯(lián)蛋白的IC50值為4.07μg/mL。由此可見，β－CN交聯(lián)后的IC50值明顯升高，即β－酪蛋白經(jīng)過多酚氧化酶催化交聯(lián)后，交聯(lián)蛋白與特異性IgG的結(jié)合能力減弱，其抗原性明顯降低。

3 討論

酶交聯(lián)蛋白技術(shù)作為一種可以有效改善食品蛋白質(zhì)功能特性的手段，已經(jīng)成功地運(yùn)用于許多食物蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的改性中，但由于交聯(lián)位點(diǎn)以及空間位阻等原因，常用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶不適于直接催化天然狀態(tài)的乳清蛋白交聯(lián)，除非加入二硫蘇糖醇等還原劑，這限制了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在乳蛋白交聯(lián)中的發(fā)展。多酚氧化酶作為一種新興的催化蛋白交聯(lián)的酶類，受到越來越多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)中研究利用雙孢蘑菇中提取的多酚氧化酶催化牛乳β－酪蛋白交聯(lián)，證明其可以有效地催化β－酪蛋白交聯(lián)，并生成多聚體形態(tài)的交聯(lián)蛋白，這進(jìn)一步驗(yàn)證和顯示了多酚氧化酶在乳蛋白交聯(lián)中的應(yīng)用潛力。

最近，Leszczyńska等研究發(fā)現(xiàn)，用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的面粉，可以使其過敏原性降低30%［12］，同時(shí)Garcia等發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶也可以降低蘋果中過敏原Mal d1的特異性IgE結(jié)合能力［13］。這一系列研究報(bào)道，預(yù)示了酶交聯(lián)技術(shù)可能成為一種降低食物過敏原性的新方法，值得深入探索。本研究結(jié)果顯示，利用多酚氧化酶催化交聯(lián)β－酪蛋白，交聯(lián)反應(yīng)生成的β－酪蛋白交聯(lián)蛋白與自然狀態(tài)的β－酪蛋白相比，其抗原性明顯降低。這可能是由于多酚氧化酶催化β－酪蛋白交聯(lián)而形成多聚體，使部分原來暴露在蛋白質(zhì)表面的過敏原表位被包裹進(jìn)蛋白質(zhì)內(nèi)部，掩蓋了原有的一些過敏原表位，因而降低β－酪蛋白的抗原性。

牛乳及乳制品因其豐富的營養(yǎng)而深受人們的喜愛，但同時(shí)，牛乳及乳制品又是一類常見的食物過敏原，流行病學(xué)研究資料顯示，2%～2.5%的嬰幼兒會(huì)對(duì)牛乳產(chǎn)生過敏反應(yīng)［14－15］，牛乳過敏的潛在性、廣泛性和長(zhǎng)期性使其成為乳制品行業(yè)發(fā)展的一大難題。目前，低致敏牛乳的生產(chǎn)主要依據(jù)酶水解技術(shù)，利用多種蛋白酶對(duì)牛乳進(jìn)行限制性水解而減少其過敏原表位，達(dá)到降低過敏原性的目的，但在水解過程中不可避免的會(huì)產(chǎn)生苦味肽，這大大影響了牛乳的風(fēng)味。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，酶交聯(lián)蛋白技術(shù)可以明顯降低牛乳的抗原性，為利用多酚氧化酶交聯(lián)制備低致敏性乳制品提供了部分理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Antigenicity changes of enzymatically crosslinked β－casein by polyphenol oxidase

CHENG Wei1，2，3，GAO Jin－yan1，4，LI Xin1，4，LIU Fa－h(huán)ui1，4，CHEN Hong－bing1，2，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China; 2.Sino－German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China; 3.School of Environmental and Chemical Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047，China; 4.School of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

The study focused on the antigenicity changes of cross－linked β－casein catalyzed by polyphenol oxidase using indirect competitive ELISA method.The SDS－PAGE profile showed that the polyphenol oxidase could catalyze the cross－linked β－casein effectively.Meanwhile，according to the results of indirect competitive ELISA，the half inhibitory concentration(IC50values)of β－casein after crosslinked changed from 2.63μg/mL into 4.07μg/mL，indicating the antigenicity of crosslinked β－casein decreased significantly.It might provide some theoretical basis for developing hypoallergenic dairy through protein crosslinking by polyphenol oxidase.

polyphenol oxidase;enzymatic cross－linking;β－casein;milk allergy

TS201.2+5

A

1002－0306(2012)08－0219－04

2011－05－23 *通訊聯(lián)系人

程偉(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:生物加工工程。

國家自然科學(xué)基金(30860220，31171716);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET－08－0704);國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAK10B03);南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SKLF－MB－201002，SKLF－TS－201109);南昌大學(xué)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目。