胡明華，梁永威，彭川叢

(1.無限極＜中國＞有限公司，廣東 廣州 510665; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，在我國分布于吉林、湖北、安徽、云南、四川、浙江、湖南、河南、福建、貴州、臺(tái)灣、廣西等地，生長栽培方式、加工炮制方法、儲(chǔ)藏條件等諸多因素會(huì)影響其化學(xué)成分的含量。茯苓中最主要的化學(xué)成分是茯苓多糖，含量可達(dá)茯苓干重的84.2%[1]，主要存在于茯苓細(xì)胞壁中，按溶解度的不同又分為水溶性茯苓多糖和堿溶性多糖。堿溶性多糖不溶于水，是一種帶有(1→6)支鏈的(1→3)鍵接的β-D-葡聚糖，經(jīng)化學(xué)改造增加其水溶性后具有顯著的抗腫瘤作用[2]。含量較低的水溶性茯苓多糖具有明顯的抗腫瘤活性[3]。筆者從產(chǎn)地和規(guī)格兩方面對(duì)茯苓水溶性多糖含量進(jìn)行研究，比較了不同產(chǎn)地、不同規(guī)格茯苓之間的含量差異?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯＜上海＞儀器有限公司);TL-5.0W型臺(tái)式離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所);PL-303型電子天平(梅特勒-托利多＜上海＞有限公司)。D-無水葡萄糖、濃硫酸、95%乙醇、苯酚均為國產(chǎn)分析純。各產(chǎn)地和規(guī)格的茯苓藥材采購于當(dāng)?shù)兀?個(gè)產(chǎn)地3種規(guī)格。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測定

2.1.1 葡萄糖對(duì)照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的 D-無水葡萄糖0.010 g，加水溶解，并定容至100 mL，混勻，制成葡萄糖對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為0.1 g/L。

2.1.2 測定條件優(yōu)選

測定波長[4-9]:精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL和供試品溶液1.0 mL，分別置20 mL試管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至2 mL，加入5%苯酚液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，然后迅速加入5 mL濃硫酸，再次混勻后，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，在紫外分光光度儀上測定400～520 nm波長之間的吸收度。結(jié)果葡萄糖對(duì)照品溶液、供試品溶液均在490 nm波長處有最大吸收，故以此為測定波長。

苯酚用量:精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL 5份，置20 mL的試管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至2 mL，分別加入5%苯酚液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻后，各加入5 mL濃硫酸，再次混勻，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，以純凈水作空白對(duì)照，在490 nm波長處測定吸光度。結(jié)果當(dāng)5%苯酚加入量為1.0 mL時(shí)，樣品的吸光度最大。

濃硫酸用量:精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL 5份，置20 mL試管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至2 mL，各加入5%苯酚液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻后，分別加入濃硫酸 3，4，5，6，7 mL，再次混勻后，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，以純凈水作空白對(duì)照，在490 nm波長處測定吸光度。結(jié)果當(dāng)濃硫酸加入量為5 mL時(shí)，樣品的吸光度最大。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置 20 mL 試管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至 2 mL，分別加入5%苯酚液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻后，加入5 mL濃硫酸，再次混勻，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，以試劑空白作對(duì)照，在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度 A為縱坐標(biāo)、葡萄糖對(duì)照品溶液加入的體積 C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 A=0.698 7 C+0.010 3，R2=0.999 7(n=6)。結(jié)果表明，葡萄糖對(duì)照溶液加入體積在0.001～0.015 mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密吸取供試品溶液1 mL，按含量測定項(xiàng)下方法操作，平行操作6份，以試劑空白作對(duì)照，測定吸光度。結(jié)果的RSD=0.92%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液0.5 mL，按含量測定項(xiàng)下方法操作，以試劑空白作對(duì)照，每隔30 min測定1次吸光度，考察樣品3 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果的 RSD=0.15%，表明供試品溶液在3 h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn):精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1 mL，按含量測定項(xiàng)下方法操作，以試劑空白作對(duì)照，連續(xù)測定5次吸光度。結(jié)果的RSD=0.06%，表明儀器精密度良好。

回收率試驗(yàn):精密吸取供試品溶液0.5 mL，加入葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，按含量測定項(xiàng)下方法操作，平行操作6份，以試劑空白作對(duì)照，測定吸光度。結(jié)果平均回收率為94.32%，RSD=0.95%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 提取工藝優(yōu)選

2.2.1 供試品溶液制備

分別取每個(gè)產(chǎn)地的3種不同規(guī)格茯苓等量混合粉碎，過60目篩，稱取10 g茯苓粉，按正交表設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行提取，趁熱用濾布過濾，濾渣用少量熱水洗滌，合并濾液，用大容量的離心機(jī)離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，濃縮至 10 mL，加入 95% 乙醇50 mL，醇沉濃度為80%，放置過夜;離心(4 000 r/min，15 min)，去掉上清液，沉淀用80%乙醇洗滌兩次，每次約15 mL，離心，傾去上清液;沉淀加入2 mol/L硫酸溶液5 mL，攪拌使其溶解，轉(zhuǎn)移至200 mL燒杯中，并加入約100 mL水，加熱至沸騰，使沉淀徹底溶解，冷卻后加水定容至500 mL，用小瓶留樣，備用，得供試品溶液。

2.2.2 含量測定

分別取1 mL供試品溶液，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，計(jì)算含量。

2.2.3 正交試驗(yàn)與結(jié)果

本試驗(yàn)選取4個(gè)主要因素，因素A為第1次煎煮時(shí)間，因素B為第1次加水量，因素C為第2次煎煮時(shí)間，因素D為第2次加水量。每個(gè)因素?cái)M2個(gè)水平，選用 L8(27)表進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平見表1，正試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2和表3可知，最優(yōu)的提取條件為A2B2C1D2，即第1次加水20倍，第1次煎煮2h，第2次加水15倍，第2次煎煮1h。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 茯苓水溶性多糖制備

2.3.1 不同產(chǎn)地茯苓水溶性多糖

分別取每個(gè)產(chǎn)地3種不同規(guī)格的茯苓，等量混合粉碎，過60目篩，稱取20 g粉末(平行操作3份)，按最優(yōu)條件進(jìn)行提取，即第1次加入20倍水(400 mL)煎煮2 h，過濾后，濾渣再加入15倍水，煎煮1 h。按2.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得溶液。

表3 方差分析

2.3.2 不同規(guī)格茯苓水溶性多糖

取湖南產(chǎn)地的茯苓藥材塊、丁和片，其中塊平均為5.0 cm×3.2 cm×0.8 cm，丁平均為0.8 cm×0.8 cm×0.6 cm，片平均為3.5 cm×1.1 cm×0.1 cm。分別取上述藥材20 g(平行操作3份)，按2.3.1項(xiàng)下方法提取、溶解，定容至500 mL。

2.4 茯苓水溶性多糖測定

分別取各產(chǎn)地和規(guī)格的供試品溶液1 mL(茯苓片取0.5 mL)，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，測定吸光度。結(jié)果見表4和表5?？梢?，湖北產(chǎn)地的茯苓水溶性多糖提取率最高，云南產(chǎn)地的茯苓水溶性多糖提取率最低;茯苓片的茯苓水溶性多糖提取率最高，塊的提取率最低。

表4 不同產(chǎn)地茯苓多糖含量測定結(jié)果

表5 不同規(guī)格茯苓多糖含量測定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各產(chǎn)地中茯苓水溶性多糖的提取率最高為湖北(0.431%)，其他依次為浙江、安徽、湖南、云南;在不同規(guī)格的茯苓中，茯苓片的多糖提取率明顯高于茯苓塊和丁，這可能是由于茯苓片得表面積較大，有利于水溶性多糖的溶出。這些結(jié)果為茯苓藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和開發(fā)利用奠定了一定基礎(chǔ)。

硫酸-苯酚比色法是測定多糖含量較經(jīng)典有效的方法之一[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，該法用于茯苓多糖的測定時(shí)，供試品溶液3 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，結(jié)果可靠。

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