顏 玲， 黃德彬， 劉錦紅, 周慶華

(1湖北民族學院醫(yī)學院，湖北 恩施 445000； 2荊楚理工學院醫(yī)學院，湖北 荊州 434000)

1000-4718(2012)09-1610-08

2012-03-30

2012-07-06

湖北省自然科學基金資助項目(No.2008ABA197)

△通訊作者 Tel: 0718-8437479；E-mail：hdb66910@163.com

黃芪多糖對腦缺血再灌注大鼠腦皮質中HSP70、PKB和P53蛋白表達的影響*

顏 玲1△， 黃德彬1， 劉錦紅1, 周慶華2

(1湖北民族學院醫(yī)學院，湖北 恩施 445000；2荊楚理工學院醫(yī)學院，湖北 荊州 434000)

目的探究黃芪多糖(AP)改善腦缺血再灌注大鼠神經功能和阻止腦皮質神經元凋亡的分子機制。方法將120只雄性Wistar大鼠隨機分成假手術組(SOG)、模型組(MG-1 d、3 d、7 d)、低劑量AP治療組(L-APTG-1 d、3 d、7 d)和高劑量AP治療組(H-APTG-1 d、3 d、7 d)。MG和APTG阻斷右側大腦中動脈形成缺血性腦損傷后，L-APTG和H-APTG分別腹腔注射AP 5 mg·kg-1和15 mg·kg-1。于1 d、3 d和7 d分別腦血流再灌注，神經功能缺損評分后處死取材，電鏡觀察神經元結構變化，流式細胞術分析神經元凋亡，免疫組化和Western blotting法檢測腦皮質神經元熱休克蛋白70(HSP70)、蛋白激酶B和P53蛋白表達。結果H-APTG神經功能缺損評分和腦皮質神經元凋亡數顯著低于MG和L-APTG(P<0.05)；電鏡下神經元結構(核糖體內質網、核仁、高爾基復合體、線粒體等)優(yōu)于MG和L-APTG；在1 d、3 d和7 d，H-APTG腦皮質神經元HSP70和PKB蛋白表達顯著高于L-APTG，后者又顯著高于MG(P<0.05)；H-APTG P53蛋白表達顯著低于L-APTG，后者又顯著低于MG(P<0.05)。結論AP能改善腦缺血再灌注神經功能損傷和抑制神經元凋亡，其機制與促進腦皮質神經元HSP70和PKB蛋白表達，抑制P53蛋白表達有關。

腦缺血再灌注; 黃芪多糖; 大腦皮質; 熱休克蛋白70; 蛋白激酶β; 抑癌蛋白P53

腦缺血可導致持續(xù)缺血缺氧，繼而引起原發(fā)缺血性損傷和繼發(fā)缺血再灌注性損傷，最終導致腦細胞不可逆的壞死與凋亡[1]。臨床表現為難以恢復的腦損傷后遺癥。目前對其治療方法主要是通過促進缺血區(qū)腦組織供血、保護腦組織和加速腦組織重建等。但這些仍未有充分的證據證實其有效性。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，AP)有調節(jié)免疫、抗氧化和延緩衰老作用[1]。我們曾研究發(fā)現AP能調控海馬部分神經遞質和c-fos mRNA表達[1]。本實驗發(fā)現AP能顯著減少腦缺血再灌注大鼠腦皮質細胞凋亡，穩(wěn)定和逆轉其超微結構，與增加熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)蛋白表達有關。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 經過行為學篩選合格的封閉群雄性Wistar大鼠120只(180～220 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。

1.2器材與試劑 石蠟包埋機(EG1150-H)、切片機(RM2245)和顯微鏡(DM2000)均為Leica產品。Pharmacia Gene Quant II型 RNA/DNA 檢測儀(Pharmacia Gene Quant Pro)。S-450D超聲波細胞破碎儀(PhD國際科技有限公司)。TP600型PCR基因擴增儀(TaKaRa)。3K30型低溫高速離心機(Sigma)。F200酶標儀(帝肯)。流式細胞儀(ELITEESP， Coulte)。臺式低溫高速離心機(Heraus)。電泳儀及電泳槽(江蘇儀器廠)。超低溫冰箱(SANYO)。倒置熒光顯微鏡(Leica)。Du-7500 紫外分光光度計(Beckman)。H-600透射電鏡(日立)。BH-2光學顯微鏡(Olympus)。全自動生化分析儀(美國思博名科學器材公司)。AP(Sigma-Aldrich)。氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)。水合氯醛(上海金貿泰化工有限公司)。RNA酶A(RNase A，Sigma)。SP免疫組化檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

2方法

2.1動物處理與神經功能分級[2-3]10%水合氯醛(350 mg·kg-1，ip)麻醉仰臥位固定，右腹股溝切開暴露股動脈插管采血(作對照分析)后備用。頸正中縱行切口(1～1.5 cm)逐層分離，充分暴露右頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。選取90只大鼠作為右側大腦中動脈阻塞模型(right middle cerebral artery occlusion，RMCAO)，在頸外動脈與頸內動脈分叉處結扎頸外動脈，同時結扎勁總動脈近心端，以動脈夾阻流遠心端，并于近心端與遠心端之間預置一縫合絲線后，在勁總動脈上剪一“V”字形切口。用Longa和Nagasawa線栓法[3]，以酒精燈燒灼單股尼龍絲線(直徑0.235 mm，長2 cm)，使其前端光滑呈圓球狀并消毒后，將絲線栓球面端插入“V”字形切口，將頸內動脈上的動脈夾松開，順勢將絲線栓由勁總動脈緩慢插入頸內動脈，直至大腦中動脈起始部，略有阻力感即停止(插入線栓長度自頸外與頸內動脈分叉處至大腦中動脈起始部約為18 mm±1 mm)，阻斷右側大腦中動脈血供[4]。隨即扎緊預置在勁總動脈上的縫合絲線(防止線栓滑脫和出血)，將各組織復位，逐層縫合。棄用術中呼吸困難、出血過多的大鼠。另30只大鼠作為假手術組(sham operation group,SOG)僅僅只將栓線插入頸內動脈6 mm，而未達大腦中動脈起始部。各組動物室溫均保持在25 ℃左右，維持正常肛溫為(37±0.5)℃。分別于動物意識恢復后30 min，藥物治療1 d、3 d、7 d斷頭取血前12 h進行神經功能缺陷評分。0分：無神經功能障礙；1分：左前爪外展不充分；2分：左轉圈式行走;3分：左傾倒式行走;4分：無法自主行走伴有意識障礙。

2.2動物分組及治療 RMCAO中篩選出1～3分合格大鼠共72只，隨機分成3組模型組(MG-1 d、3 d、7 d，n=8)、3組低劑量AP治療組(L-APTG-1 d、3 d、7 d，n=8)和3組高劑量AP治療組(H-APTG-1 d、3 d、7 d，n=8)。SOG中篩選出1～3分合格大鼠共27只，隨機分成3組假手術組(SOG-1 d、3 d、7 d，n=9)。L-APTG和H-APTG術后分別每天2次 AP 5 mg·kg-1和15 mg·kg-1(ip,以生理鹽水稀釋成2 mL)，直至處死取材。SOG和MG術后每天2次注射等容量生理鹽水(ip)。

2.3HE染色與透射電鏡觀察 分別于術后1 d、3 d和7 d，最后1次腹腔注射藥物后，禁食12 h斷頭取血，使頭置于冰塊上開顱取出腦，迅速置于墊有冰盤的濾紙上，以生理鹽水沖洗3～5次后，剝離出大腦皮層，左側大腦皮層組織作為對照切片。生理鹽水沖洗3～5次，分別取出部分大腦皮層額葉、頂葉、枕葉以及視交叉。用LKBⅢ型超薄切片機從前至后連續(xù)冠狀切片各3張(5～8 μm)，放入4%多聚甲醛固定液中固定24 h后，石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡下觀察。取出相應腦皮質組織以2%戊二醛溶液固定24 h后，PBS(0.1 mol/L)漂洗，1%鋨酸固定(1.5 h)，用丙酮和乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂(Epon 812)等比混合浸透和包埋，超薄切片機切片(50～70 nm)，醋酸鈾和檸檬酸鉛后染色電鏡下觀察和拍片。

2.4細胞凋亡率檢測 于各時點分別取出少量大腦額頂葉皮質(60 mg)于冰盤上用眼科剪剪碎，將碎片組織置于300目銅網，以PBS液沖洗3次，制成單細胞懸液(網搓法)，加入PBS(0.1 mol/L)稀釋成10 mL，反復30次吹打后，沉淀10 min，再經10 min離心(3 000 r/min)，棄去上清液，加冷卻的乙醇5 mL (75%)混勻，于4 ℃冰箱靜置12 h后， 經10 min離心(3 000 r/min)，第2次棄上清液。加入PBS(0.1 mol/L)5 mL稀釋混均，再次離心10 min，棄上清液。吸取沉淀物，將細胞濃度調整為2×109·L-1，吸取取細胞懸液1 mL加入1.6 mL RNase (1 g·L-1)，置入水浴箱中，孵育30 min(37 ℃)后離心 10 min，吸取沉淀物加到PBS 0.4 mL中稀釋，加200 μL PI染色液染色30 min(4 ℃，通光)。上流式細胞儀，繪制DNA含量圖，以G1峰前亞二倍體峰(Ap)百分比作為細胞凋亡率(功率300 mW，離子激發(fā)光波長488 nm)。其染色陽性細胞數通過計算機軟件處理。剩下腦皮質組織分別迅速放入5 mL的清潔塑料離心管，置于冰箱備用(-85 ℃)，分別檢測腦皮質勻漿HSP70、PKB和P53蛋白表達。

2.5腦皮質HSP70、PKB和P53蛋白表達的測定

2.5.1免疫組化測定 玻片以3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane，APES)掛膠和撈片后，上烤片機1 h(60 ℃)，經過一系列的固定、脫水、透明、包埋和切片后，于載玻片上(經過防脫片劑處理)放入烤箱(24 h，60 ℃)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ炃衅撓炈?%H2O2室溫孵育15 min，分別以蒸餾水和PBS各沖洗3次(每次5 min)，中低火微波修復抗原(15 min)，冷卻至室溫。以PBS沖洗3次，滴入Ⅰ抗工作液(HSP70、PKB和P53濃度分別為1∶100、1∶20和1∶50)。置于4 ℃冰箱24 h，以PBS沖洗3次后，滴入山羊抗兔IgG抗體，室溫下經過20 min孵育，以PBS沖洗3次，DAB 底物工作液滴于切片上，顯微鏡下控制顯色，自來水終止顯色反應。乙醇梯度脫水，用二甲苯透明，中性樹脂封片后觀察。將棕黃色的細胞核或細胞漿定為陽性細胞。光鏡放大400倍，選擇5個不重疊的缺血梗死灶周邊區(qū)皮質視野作為計數陽性細胞，記錄每100個細胞中陽性細胞數的平均值。

2.5.2Western blotting測定 將樣品放入4 ℃預冷處理后的勻漿器，以PBS勻漿至清澈后去除上清液，加入裂解緩沖液裂解約40 min后，離心15 min(12 000 r/min)取上清分裝。以BCA試劑盒測定蛋白質含量。于提取的蛋白樣品中加入等體積2×loading buffer混勻。變性處理(100 ℃沸水中煮3 min)后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?2% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，HSP70、PKB和P53蛋白分別按每孔蛋白上樣量為50 μg、30 μg和20 μg，以積層膠80 V、分離膠120 V恒壓分別電泳，待溴酚藍移至膠底部后終止電泳。以甲醇將PVDF膜激活1 min后轉膜，300 mA恒流轉膜2.5 h(4 ℃)，將凝膠上蛋白質移至PVDF膜上。待轉膜結束后，以TBST脫脂奶粉(5%)封閉液封閉PVDF膜2 h后，加入相應兔抗HSP70、PKB和P53多克隆抗體(1∶1 000) 、β-actin (1∶600) 4 ℃過夜。用5%TBST洗滌3次(15 min×1次，10 min×2次)，Ⅱ抗以生物素標記羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育1 h，再以5%TBST洗3次(每次5 min)，經ECL 發(fā)光試劑盒顯影，X射線底片曝光。以β-actin為內參照。實驗重復6次后，將蛋白印跡顯影圖像掃描。用Quantity One軟件半定量分析，用相應蛋白灰度值與內參照β-actin灰度值比值表示各組樣品相應蛋白的表達水平。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1AP對RMCAO大鼠神經功能缺損的影響

除SOG外，各大鼠麻醉清醒后均出現不同程度的神經功能缺損癥狀。表現為：左側肢體無力，行走時左傾斜或左轉圈，少數出現意識障礙，不能行走；右側眼裂變窄，瞳孔縮小(Horner’s征陽性)；提尾時左前肢活動障礙，左前爪不能全伸展，有的后肢屈曲。隨給藥時間的變化，大鼠神經功能缺損也隨之變化。術后1 d、3 d和7 d，H-APTG神經功能缺損評分顯著低于其它各組(P<0.05或P<0.01)；術后3 d和7 d，L-APTG神經功能缺損評分顯著低于MG(P<0.05)，表明AP對腦缺血再灌注引起的腦神經功能缺損有改善作用，而且呈劑量依賴性，見表1。

表1AP對RMCAO大鼠神經功能評分的影響

Groupn30min1d3d7dSOG90000MG82．53±0．522．48±0．362．36±0．541．97±0．18L-APTG82．68±0．682．29±0．532．07±0．61?1．46±0．24?H-APTG82．57±0．492．12±0．39?1．62±0．43?△1．03±0．17?△

*P<0.05vsMG and SOG；△P<0.05vsL-APTG.

2術后7dAP對RMCAO大鼠大腦皮質病理學變化的影響

2.1HE染色觀察結果 術后7 d，MG大腦皮質神經纖維仍有大量空泡，部分變性壞死的神經細胞被吸收，很多細胞著色變淺，排列紊亂，部分細胞膜與周圍融合，多數細胞核固縮，核仁幾乎全部消失，梗死灶的外周可見大量凋亡的細胞和皺縮的細胞漿，細胞核明顯固縮集邊；與MG相比，L-APTG病理改變明顯減輕，大腦皮質僅見少量散在的神經纖維空泡，明顯少于MG，其散亂的細胞排列、水腫的組織、暗淡的著色、縮小的細胞以及固縮的細胞核數量顯著少于MG，而多于H-APTG，見圖1。

Figure 1. Effects ofAstragaluspolysaccharide on histopathological changes of cerebral cortex in rats (HE staining，×200).

圖1AP對大鼠大腦皮質病理學改變的影響

2.2透射電鏡觀察結果 術后7 d，MG大腦皮質細胞膜模糊，細胞漿內可見大量空泡；細胞核皺縮成馬蹄形或分葉狀，所有染色質凝聚成各種形態(tài)，附于核膜外周，染色加深；細胞內的細胞器明顯變形、減少或消失，網狀結構模糊或缺失；可見氣球樣腫脹的線粒體，嵴少甚至缺失；粗面內質網幾乎消失，質膜結構模糊不清或不連續(xù)，甚至消失；L-APTG大腦皮質細胞膜大多模糊不清，細胞漿內可見部分空泡；部分細胞核皺縮，多數染色質凝聚成多種形態(tài)，染色較MG變淺；細胞內的細胞器部分變形或減少，網狀結構不明顯而且較模糊；可見輕微腫脹的線粒體，嵴少散在；粗面內質網尚存，質膜結構稍模糊。H-APTG大腦皮質細胞膜較清晰，細胞漿內未見空泡；胞漿輕微濃縮，細胞膜、細胞器膜和核膜均完整；少數細胞核皺縮，僅見細胞核少數常染色質固縮不規(guī)則，疏松，罕見染色質凝聚，染色深度接近SOG；細胞內的細胞器近乎完整清晰，網狀結構較明顯；線粒體無明顯腫脹，呈圓或卵圓形，嵴多而清晰，近于SOG；粗面內質網、核糖體和質膜結構較完整，核糖體腫脹不明顯，少數溶解；胞漿蛋白與核蛋白成分較SOG略為松散，見圖2。

Figure 2. Effects ofAstragaluspolysaccharide on neuronal ultrastructure of cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats (transmission electron microscopy，×16 500).

圖2AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元超微結構的影響

3AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元凋亡率的影響

流式細胞術分析結果顯示，各時點的細胞凋亡率SOG顯著低于其它各組(P<0.05)；術后1 d，MG與L-APTG相當(P>0.05)，而H-APTG顯著低于MG(P<0.05)；術后3 d和7 d，L-APTG顯著低于MG(P<0.05)，而H-APTG又顯著低于L-APTG和MG(P<0.05)，顯示AP有明顯抗RMCAO大鼠大腦皮質神經元凋亡作用，而且呈現劑量依賴趨勢，見圖3、表2。

Figure 3. Effects ofAstragaluspolysaccharide on apoptotic rate of cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats.

圖3AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元凋亡率的影響

表2AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元凋亡率的影響

Groupn1d3d7dSOG91．78±0．031．96±0．061．84±0．08MG89．73±0．49?8．83±0．63?8．18±0．71?L-APTG88．97±0．67?6．56±0．33?▲5．08±0．45?▲H-APTG87．84±0．35?▲5．01±0．51?△▲2．64±0．63?△▲

*P<0.05vsSOG；△P<0.05vsL-APTG；▲P<0.05vsMG.

4AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元HSP70表達的影響

在各時點，SOG的HSP70表達無顯著變化，其它各組在術后HSP70表達先升高，然后逐漸減低；在各個時點，SOG顯著低于其它各組(P<0.05)，L-APTG和H-APTG顯著高于MG，而H-APTG又顯著高于L-APTG(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性促進或維持HSP70的表達，見圖4、表3。

Figure 4. Effects ofAstragaluspolysaccharide on HSP70 expression in cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats (SABC，×400).

圖4AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元HSP70表達的影響

表3AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元HSP70表達的影響

Groupn1d3d7dSOG92．23±0．612．17±0．462．72±0．65MG827．34±3．56?22．86±4．74?19．89±2．57?L-APTG834．78±5．32?27．53±3．42?▲25．63±4．57?H-APTG839．76±4．36?△▲36．74±5．69?△▲34．51±3．74?△▲

*P<0.05vsSOG；△P<0.05vsL-APTG；▲P<0.05vsMG.

5AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元PKB蛋白表達的影響

PKB蛋白表達結果顯示，在各時點，SOG無顯著變化，顯著低于其它各組(P<0.05)；隨時間推移，MG、L-APTG與H-APTG的PKB蛋白表達呈現持續(xù)小幅度增加，3組之間有顯著差異，顯示MG

圖5AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元PKB蛋白表達的影響

Figure 6. Effects ofAstragaluspolysaccharide on PKB protein expression in cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats(SABC，×400).

圖6AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元PKB蛋白表達的影響

6AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元P53蛋白表達的影響

在各時點，SOG P53蛋白表達無顯著變化，顯著低于其它各組(P<0.05)；隨時間推移，MG、L-APTG與H-APTG P53蛋白表達呈現持續(xù)降低，3組之間差異顯著，為MG>L-APTG>H-APTG(P<0.05)。免疫組化切片染色也顯示相似結果。這表明腦缺血再灌注導致大鼠腦損傷，AP能抑制大腦皮質神經元P53蛋白表達，且劑量越大，這種抑制作用越強，見圖7、8。

圖7AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元P53蛋白表達的影響

Figure 8. Effects ofAstragaluspolysaccharide on P53 protein expression in cerebral cortical neurons after right middle cerebral artery occlusion in rats(SABC，×400).

圖8AP對RMCAO大鼠大腦皮質神經元P53蛋白表達的影響

討 論

大腦皮質神經元對缺血缺氧性損害很敏感，若腦缺血使得腦能量代謝障礙，直接導致神經元內外離子的平衡失調，大量Na+、Ca2+積聚于神經元內，引起神經元水腫，甚至破裂[5-6]，隨即發(fā)生皮質神經元的凋亡。當缺血損傷消除后，損傷神經元逐漸修復與再生，其修復與再生過程伴隨相關蛋白的表達(c-Fos，Bcl-2，P53，PKB，HSP70)而調控著神經元的修復與再生[7]。使用有效藥物干預這些相關蛋白的表達，是促進損傷神經元修復與再生的基礎。AP是從中藥黃芪(Astragalusmongholicus)中提取的多糖類物質，有保護腦組織、延緩衰老、抗氧化、改善細胞代謝以及調節(jié)免疫等多重藥理作用[8]。本研究結果發(fā)現，通過下列因素發(fā)揮對腦的保護作用，表現為呈劑量依賴性降低缺血再灌注導致的腦損傷大鼠的神經功能評分，減輕神經組織的水腫，阻止神經元胞核的固縮，降低神經元的凋亡率，延緩神經元胞漿的濃縮進程，阻止神經元胞核的皺縮和線粒體的腫脹，維持神經元內細胞器結構的完整性，降低神經元凋亡率。其作用機制可能與下列因素有關。

1誘導大腦皮質神經元HSP70表達，阻止神經元自殺途徑的開啟，增強神經元對缺血再灌注的耐受性，減少神經元凋亡

中樞神經的HSP70是抗凋亡蛋白，通過熱休克反應能保護或減輕神經細胞的損傷[9]。其主要功能是：直接保護神經元，啟動產生其它保護機制；增強神經元對應激原的耐受性；應激狀態(tài)下維持神經元內蛋白的自穩(wěn)，結合變性蛋白，防止變性蛋白進一步折疊而失去功能；轉運細胞內新合成蛋白質，迅速清除和恢復受損蛋白質，以維持細胞的正常生存；調節(jié)神經元細胞周期；充當分子伴侶，參與調節(jié)免疫[10]。腦缺血可引起熱休克反應，增強HSP70表達，阻止神經元開啟自殺途徑，減輕神經元凋亡[7]。有研究發(fā)現，HSP70抑制劑能加速腦缺血后神經元的凋亡進程[8]。本實驗結果顯示，在腦缺血后1 d、3 d和7 d，假手術組HSP70表達顯著低于其它各組(P<0.05)，低劑量和高劑量AP治療組顯著高于模型對照組，而高劑量AP治療組又顯著高于低劑量AP治療組(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性促進或維持HSP70的表達。這有助于保護缺血引起的神經元損傷，增加腦組織的修復與再生能力，提示AP增強腦缺血神經功能的機制，與誘導神經元HSP70的表達而保護神經元、阻止神經元凋亡有關。

2激活腦皮質神經元PKB蛋白表達，阻止神經元凋亡，增強神經元的生存功能

PKB(Akt)是存在于神經細胞的一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，其Thr308和Ser473位點能在PI3K作用下磷酸化而激活，隨即發(fā)揮抗細胞凋亡、促細胞生存等多種生物效應[7]。研究已經證實，激活的PKB作用于多種底物(forkhead轉錄因子、eNOS、GsK-3、BAD、CREB、caspase-9等)或下游環(huán)節(jié)而促進神經細胞生存[8]。短暫腦缺血早期，相對損傷較輕部位(大腦皮質)磷酸化的PKB表達也相對增加，這種腦缺血早期的特殊保護反應，與促進神經細胞存活有關[1,10]。有研究發(fā)現，短暫全腦缺血早期階段，缺血損傷相對較輕的部位(如大腦皮質區(qū))磷酸化PKB表達增高[9]。沙土鼠全腦缺血再灌注模型實驗發(fā)現，磷酸化的PKB核表達明顯增加，表明PKB的激活與增強腦缺血的耐受性有關[3,9]。以上事實說明，腦缺血早期PKB的激活是機體對腦缺血的一種保護性反映，與促進細胞存活有關。本實驗結果顯示，在腦缺血后1 d、3 d和7 d，假手術組PKB蛋白表達少于模型對照組(P<0.05)，表明腦缺血可以誘導PKB蛋白表達。低劑量和高劑量AP治療組PKB蛋白表達顯著高于模型對照組，而高劑量AP治療組又顯著高于低劑量AP治療組(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性加快并維持腦缺血再灌注大鼠腦皮質神經元PKB蛋白高水平表達。這提示AP抗腦缺血再灌注神經損傷的機制與促進PKB蛋白的表達和細胞存活有關。

3抑制腦皮質神經元P53蛋白表達，從而阻止其下游基因介導的凋亡基因的表達

腦缺血再灌注導致神經元凋亡的關鍵環(huán)節(jié)受凋亡基因p53的調控，是誘導腦缺血再灌注神經元凋亡的主要因素[8-9]。P53在正常組織中的表達極低，這對阻止基因突變和穩(wěn)定染色體DNA具有重要意義[9-10]。如果DNA受到外來影響(輻射、缺氧、缺血等)，作為轉錄因子的P53可誘導下游基因表達，導致細胞凋亡或細胞周期停滯[9]。有研究證實，腦缺血可增加P53表達，P53表達抑制劑具有保護腦組織作用[8]。P53還能減少Bcl-2蛋白(抗細胞凋亡蛋白)表達，增強Bax蛋白(促細胞凋亡蛋白)表達，并調節(jié) Bax、caspase等系列下游基因而促進神經細胞凋亡[10]。因此，p53基因具有促進神經細胞凋亡作用。本實驗結果顯示，在腦缺血后1 d、3 d和7 d，假手術組P53蛋白表達低于其它各組(P<0.05)，模型對照組顯著高于低劑量AP治療組，而低劑量AP治療組又顯著高于高劑量AP治療組(P<0.05)，表明AP呈劑量依賴性抑制腦缺血再灌注大鼠腦皮質神經元P53蛋白的表達。這提示AP抗腦缺血再灌注神經損傷的機制與抑制P53蛋白表達相關。

[1] 顏 玲，黃德斌．黃芪多糖對缺血腦損傷大鼠海馬神經遞質及c-fos mRNA表達的影響[J]．中國病理生理雜志，2012，28(2)：263-268．

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EffectsofAstragaluspolysaccharideonexpressionofHSP70,PKBandP53inratcerebralcortexwithcerebralischemiaandreperfusion

YAN Ling1, HUANG De-bin1, LIU Jin-hong1, ZHOU Qing-hua2

(1MedicalCollegeofHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China;2MedicalCollegeofJingchuUniversityofTechnology,Jingzhou434000,China.E-mail:hdb66910@163.com)

AIM: To explore the molecular effects ofAstragaluspolysaccharide (AP) on improving nervous functions and preventing neuronal apoptosis in rat cerebral cortex with cerebral ischemia and reperfusion.METHODSOne hundred and twenty male Wister rats were randomly divided into sham operation group (SOG), model groups (MG-1 d, 3 d and 7 d), low-dose AP treatment groups (L-APTG-1 d, 3 d and 7 d), and high-dose AP treatment groups (H-APTG-1 d, 3 d and 7 d). The right middle cerebral artery of the rats in MG and AGTG was intercepted by operation to induce ischemic brain injury. The rats in L-APTG and H-APTG were treated with AP at the doses of 5 mg/kg and 15 mg/kg by intraperitoneal injection, respectively. On the 1st day, 3rd day and 7th day after operation, those animals were sacrificed to collect the brain specimens for the study after cerebral blood flow reperfusion and determination of neurological deficit scores. The structural changes of the neurons were observed under electron microscope. Apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of heat-shock protein 70 (HSP70), protein kinase B (PKB) and P53 in cerebral corical neurons were determined by immunohistochemical staining and Western blotting.RESULTSThe neurological deficit scores and the apoptotic rate of cerebral cortical neurons in H-APTG were significantly lower than those in MG and L-APTG (P<0.05). The structures of the neurons in H-APTG, such as ribosome endoplasmic reticulum, nucleolus, Golgi complex, mitochondria, etc, were better than those in MG and L-APTG. On the 1st day, 3rd day and 7th day, the protein levels of HSP70 and PKB in cerebral cortical neurons in H-APTG were significantly higher than those in L-APTG, which were significantly higher than those in MG (P<0.05). However, the P53 protein level in H-APTG was significantly lower than that in L-APTG, which was significantly lower than that in MG (P<0.05).CONCLUSIONAP improves nervous functions and inhibits neuronal apoptosis during ischemia and reperfusion. The molecular mechanisms are associated with variations of protein expression in cerebral cortical neurons, such as promotion of HSP70 and PKB and inhibition of P53.

Brain ischemia reperfusion;Astragaluspolysaccharide; Cerebral cortex; Heat-shock protein 70; Protein kinase B; Tumor suppressor protein P53

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.013