許銘炎， 鄧小玲， 陳錫和， 楊利和， 姚小武， 傅玉才

(汕頭大學醫(yī)學院 1第二附屬醫(yī)院口腔科，2細胞生物與遺傳學教研室，3細胞衰老實驗室，廣東 汕頭 515041)

1000-4718(2012)03-0488-04

2011-10-22

2011-12-14

國家自然科學基金資助項目(No. 81072208)；廣東省自然科學基金資助項目(No. S2011010005106)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(No.A2010407)；汕頭大學醫(yī)學院基礎與臨床科研基金資助項目

△通訊作者 Tel: 0754-88900497; E-mail: caseydxl@yahoo.com

溶血磷脂酸對上皮細胞整合素β6表達的影響*

許銘炎1， 鄧小玲2△， 陳錫和3， 楊利和1， 姚小武1， 傅玉才3

(汕頭大學醫(yī)學院1第二附屬醫(yī)院口腔科，2細胞生物與遺傳學教研室，3細胞衰老實驗室，廣東 汕頭 515041)

目的探討溶血磷脂酸(LPA)在體外對整合素β6(ITGB6)表達的影響，并進一步研究LPA誘導的活化轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在此過程中的作用。方法原代培養(yǎng)的正常人支氣管上皮(NHBE)細胞接種于6孔板中，經(jīng)LPA誘導，收集細胞，分別利用RT-PCR和流式細胞術檢測ITGB6 mRNA及細胞表面蛋白的表達；利用轉(zhuǎn)染有TGF-β應答性纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)啟動子片段并融合螢火蟲熒光報告基因片段的轉(zhuǎn)化貂肺上皮細胞(TMLC)作為TGF-β活性報告細胞檢測活化的TGF-β。結(jié)果(1) 10 μmol/L LPA誘導2 h后，ITGB6 mRNA在上皮細胞中表達顯著增加，具有明顯的時間依賴性。(2) 10 μmol/L LPA誘導4 h后，上皮細胞表面ITGB6蛋白表達明顯增加。(3) 抗αVβ6抗體可阻斷LPA誘導的活化TGF-β，但不能阻斷LPA誘導的ITGB6 mRNA的表達。結(jié)論(1) LPA可誘導上皮細胞ITGB6 mRNA和細胞表面蛋白的表達。(2) LPA誘導的ITGB6 mRNA 表達不依賴LPA 誘導的TGF-β活化。

溶血磷脂酸； 整合素β6； 上皮細胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β

整合素αVβ6是由αV亞單位和β6亞單位組成的跨膜異二聚體，是一種只特異性在上皮組織中表達的特殊亞型整合素[1]。它在正常上皮組織中幾乎沒表達，但在創(chuàng)傷愈合、炎癥反應及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移時表達上調(diào)，參與上皮組織的重建修復及上皮組織源性惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-6]，但影響其表達的具體因素并未完全闡明。雖然有報道轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)可上調(diào)整合素αVβ6的表達[7]，但上皮重建及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中需要多種生物活性物質(zhì)參與，有必要進一步探討影響αVβ6表達的其它因素。由于整合素β6亞單位(integrin β6, ITGB6)只能與αV亞單位形成，因此,ITGB6是αVβ6的關鍵性亞單位，可通過研究ITGB6的表達體現(xiàn)整個異二聚體αVβ6的表達狀態(tài)。

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA) 是一種具有類生長因子活性的磷脂分子，存在于血漿、血清、唾液等多種體液中，促進細胞增殖、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細胞骨架改變以及腫瘤細胞移動和侵襲等[8]，參與上皮創(chuàng)傷修復及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種疾病的病理生理過程[9]。我們前期報道了LPA可誘導整合素αVβ6介導TGF-β的活化，參與組織纖維化進程[10]，但尚不清楚LPA是否可影響整合素αVβ6的表達，同時也不清楚整合素αVβ6的表達是否與LPA誘導的TGF-β活化存在相互作用。因此，本文以表達有整合素αVβ6的支氣管上皮細胞NHBE為研究對象，探討LPA對上皮細胞ITGB6表達的影響及其與TGF-β活化的關系，進而解析LPA對整合素αVβ6表達的影響。

材 料 和 方 法

1細胞株和試劑

正常人支氣管上皮(normal human bronchial epithelial,NHBE)細胞株及培養(yǎng)基購自Lonza。轉(zhuǎn)化貂肺上皮細胞(transformed mink lung epithelial cells,TMLC)由Dr.Rifkin 惠贈。LPA購自Sigma?？拐纤卅罺β6單克隆抗體10D5和PE標記的羊抗鼠免疫球蛋白IgG均購自Chemicon?？筎GF-β的抗體1D11購自R&D。總RNA提取試劑盒購自北京東盛生物公司。cDNA合成及PCR反應試劑盒購自北京TransGen Biotech。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) NHBE細胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，用KSF完全培養(yǎng)劑(含1.5 mg/L BSA、50 nmol/L EGF, 100 mg/L 青、鏈霉素)，于37 ℃、50% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3代以內(nèi)的NHBE細胞接種于6孔培養(yǎng)板各孔內(nèi)，用2 mL 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后換無輔助培養(yǎng)劑的KSF培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。實驗時，對照組內(nèi)加入無輔助培養(yǎng)劑的KSF培養(yǎng)液，其它組每孔細胞內(nèi)加入LPA(10 μmol/L)，分別培養(yǎng)0、15 min、1 h、2 h、4 h和6 h后收取細胞用于檢測ITGB6 mRNA水平。

2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測ITGB6 mRNA表達 應用通用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，1 μg總RNA經(jīng) EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA， 取1μL cDNA利用ITGB6引物及GAPDH 引物進行PCR 反應( 2 × EasyTaq PCR SuperMix 試劑盒)，反應條件： 95 ℃預變性2 min，1個循環(huán)；接著95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán)；最終將PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄實驗結(jié)果，利用Photoshop軟件對條帶進行灰度分析。 ITGB6的上游引物5’-TCTGGAGTTGGCGAAAGG-3’，下游引物 5’-TCCACCGGGTAGTCCTCA-3’，產(chǎn)物片段245 bp。 GAPDH的上游引物5’- CAATGACCCCTTCATTGACCTC -3’，下游引物5’- CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3’，產(chǎn)物片段143 bp。

2.3流式細胞術檢測細胞表面ITGB6蛋白的表達 用胰蛋白酶(trypsin)/EDTA收集單層培養(yǎng)的細胞，用羊血清在4 ℃下封閉20 min，1 000 r/min 離心沉淀細胞，用含有鈣離子和鎂離子的PBS漂洗1次，1 000 r/min 離心棄上清，在抗αVβ6的單克隆抗體10D5(10 g/L)中4 ℃下孵化20 min，接著用含有鈣離子和鎂離子的PBS漂洗2次，以標記藻紅蛋白的Ⅱ抗羊抗鼠IgG(1∶200) 4 ℃染色20 min，然后再用PBS漂洗2次，取0.5 mL PBS重懸液在流式細胞儀中進行檢測。

2.4TGF-β活性的檢測 利用轉(zhuǎn)染有TGF-β應答性纖溶酶原激活抑制劑1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)啟動子片段并融合螢火蟲熒光報告基因片段的TMLC作為TGF-β活性報告細胞檢測活化的TGF-β。TMLC在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長16 h后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)2 h，利用胰酶消化收集細胞，用無血清的DMEM重懸為5×108cells/L，根據(jù)實驗需要加入抗αVβ6抗體(5 g/L)或TGF-β抗體(10 g/L)，取100 μL/well TMLC懸液加入已接種NHBE細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中進行共培養(yǎng)，同時加入100 μL不同濃度的LPA進入共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)過夜后，吸棄上清，用PBS漂洗1次，加入報告基因系統(tǒng)細胞裂解液(Promega,北京)，充分振蕩裂解，1 500×g4 ℃離心5 min，收集上清，加入熒光素酶分析緩沖液，用熒光發(fā)光檢測儀進行檢測。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1LPA誘導上皮細胞ITGB6mRNA表達呈時間依賴性

RT-PCR結(jié)果顯示，LPA作用2 h后即可誘導ITGB6 mRNA表達增加(P<0.05)，隨著作用時間延長，ITGB6 mRNA的表達量顯著增加，具有明顯的時間依賴性，見圖1。

圖1LPA誘導上皮細胞ITGB6mRNA表達

2LPA誘導上皮細胞表面ITGB6蛋白表達

結(jié)果顯示，NHBE 細胞表面可檢測到ITGB6的表達峰，經(jīng)LPA誘導4 h后，ITGB6表達峰明顯右移，見圖2，提示細胞表面的ITGB6表達增加。

3LPA上調(diào)ITGB6表達不依賴活化的TGF-β

結(jié)果顯示,LPA可誘導支氣管上皮細胞TGF-β的活化，且呈劑量依賴性，所誘導的活化TGF-β可被抗αVβ6抗體及抗TGF-β抗體阻斷，見圖3A；但RT-PCR結(jié)果顯示抗αVβ6抗體不能阻斷LPA誘導的ITGB6表達，提示LPA上調(diào)ITGB6的表達不依賴活化TGF-β的生成，見圖3B。

討 論

整合素αVβ6是一種重要的細胞黏附分子，探討影響其表達的相關因素，有利于正確解釋αVβ6在上皮炎癥應答、重建修復及上皮源性惡性腫瘤中過度表達的分子機制，也為組織特異性下調(diào)整合素αVβ6表達提供新思路，并為尋找新的有效干預靶點奠定理論基礎。

Figure 2. The expression of ITGB6 on epithelial cell surfaces was detected by flow cytometry.

圖2上皮細胞表面ITGB6的表達

LPA作為一種重要的細胞外信號遞質(zhì)和細胞內(nèi)第二信使。在正常生理狀態(tài)下，具有促進細胞有絲分裂、影響細胞形態(tài)、加速傷口愈合等生理功能[11]；近年來研究發(fā)現(xiàn)LPA與腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性化程度密切相關[12]；這些生物作用與整合素αVβ6有重疊。本研究通過RT-PCR及流式細胞檢測技術發(fā)現(xiàn)，LPA可誘導上皮細胞ITGB6 mRNA和細胞表面蛋白表達，且呈時間依賴性，提示LPA的生物作用可能部分通過整合素αVβ6起作用，這可能是兩者間生物功能重疊的原因之一。

我們的前期研究報道了LPA可誘導TGF-β的活化[10]，而TGF-β能上調(diào)ITGB6的表達，但我們通過抗體阻斷實驗，發(fā)現(xiàn)LPA誘導ITGB6表達不依賴于活化的TGF-β,也就是說，LPA對ITGB6表達的影響不需要通過活化的TGF-β，這提示LPA可能直接作用于ITGB6表達的調(diào)控元件，影響ITGB6的轉(zhuǎn)錄和翻譯；另一方面提示LPA上調(diào)ITGB6表達的信號轉(zhuǎn)導途徑可能不同于LPA誘導TGF-β活化的信號轉(zhuǎn)導途徑，確切機制需要在以后的研究中進一步證實。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)LPA是一種新的ITGB6表達誘導劑，這為ITGB6表達調(diào)控的研究提供另一誘導工具，也為αVβ6表達調(diào)控機制研究奠定了基礎。同時，我們的結(jié)果提示LPA可能通過新的基因表達調(diào)控通路及信號轉(zhuǎn)導分子影響整合素αVβ6的表達，這將進一步豐富基因調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導通路理論。

圖3LPA上調(diào)ITGB6表達不依賴活化的TGF-β

[1] Breuss JM, Gillett N, Lu L, et al. Restricted distribution of integrin beta 6 mRNA in primate epithelial tissues[J]. J Histochem Cytochem， 1993, 41(10):1521-1527.

[2] Huang XZ, Wu JF, Cass D, et al. Inactivation of the integrin beta 6 subunit gene reveals a role of epithelial integrins in regulating inflammation in the lung and skin[J]. J Cell Biol，1996, 133(4):921-928.

[3] Huang X, Wu J, Spong S, et al. The integrin αvβ6 is critical for keratinocyte migration on both its known ligand, fibronectin, and on vitronectin[J]. J Cell Sci， 1998, 111(Pt 15):2189-2195.

[4] Niu J, Gu X, Ahmed N, et al. The αvβ6 integrin regulates its own expression with cell crowding: implications for tumour progression[J]. Int J Cancer， 2001, 92(1):40-48.

[5] 張 琦，胡燕燕，彭 程，等. αvβ6-ERK直接通路參與去甲斑蝥素誘導HT-29結(jié)腸癌細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志， 2011, 27(8):1525-1530.

[6] Thomas GJ, Nystrom ML, Marshall JF. αvβ6 integrin in wound healing and cancer of the oral cavity[J]. J Oral Pathol Med， 2006, 35(1):1-10.

[7] Sheppard D, Cohen DS, Wang A, et al. Transforming growth factor beta differentially regulates expression of integrin subunits in guinea pig airway epithelial cells[J]. J Biol Chem， 1992, 267(24):17409-17414.

[8] 周志斌，張志珺. 溶血磷脂酸與血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化[J]. 中國病理生理雜志， 2009, 25(6):1228-1231.

[9] Lin ME, Herr DR, Chun J. Lysophosphatidic acid (LPA) receptors: signaling properties and disease relevance[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat， 2010, 91(3-4):130-138.

[10]Xu MY, Porte J, Knox AJ, et al. Lysophosphatidic acid induces αvβ6 integrin-mediated TGF-β activation via the LPA2 receptor and the small G protein Gαq[J]. Am J Pathol， 2009, 174(4):1264-1279.

[11]劉玉萍，王穎鈺，錢文慧. 溶血磷脂酸(LPA) 對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用研究[J]. 中國藥理學通報， 2011, 27(8):1044-1047.

[12]Mills GB, Moolenaar WH. The emerging role of lysophosphatidic acid in cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2003, 3(8):582-591.

Effectoflysophosphatidicacidonexpressionofintegrinβ6inepithelialcells

XU Ming-yan1, DENG Xiao-ling2, CHEN Xi-he3, YANG Li-he1, YAO Xiao-wu1, FU Yu-cai3

(1DepartmentofStomatology,TheSecondAffiliatedHospital,2DepartmentofCellBiologyandGenetics,3LaboratoryofCellSenescence,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:caseydxl@yahoo.com)

AIM: To investigate the effect of lysophosphatidic acid (LPA) on the expression of integrin β6(ITGB6) for determining the role of transforming growth factor β (TGF-β) activation induced by LPA in this process.METHODSNormal human bronchial epithelial (NHBE) cells were primarily cultured in 6 well plate and stimulated with LPA. The mRNA expression of ITGB6 and the level of cell surface ITGB6 protein were detected by RT-PCR and flow cytometry,respectively. The activity of active TGF-β induced by LPA was measured by the method of transformed mink lung epithelial cells (TMLC) transfected with TGF-β responsive plasminogen activator inhibitor 1(PAI-1) promoter fused with firefly luciferase reporter gene.RESULTSAfter stimulated with LPA at concentration of 10 μmol/L for 2 h, the mRNA expression of ITGB6 in epithelial cells was significantly increased in a time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that the protein level of ITGB6 on cell surface was obviously increased after treated with LPA at concentration of 10 μmol/L for 4 h. The active TGF-β induced by LPA in epithelial cells was blocked by an αVβ6blocking antibody. However, αVβ6blocking antibody failed to inhibit the mRNA expression of ITGB6 induced by LPA.CONCLUSIONLPA induces the mRNA and cell surface protein of ITGB6 in epithelial cells. The up-regulated ITGB6 expression by LPA is independent on LPA-induced TGF-β activation.

Lysophosphatidic acid; Integrin β6; Epithelial cells; Transforming growth factor beta

R735.35

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.018