南慶玲， 陽 誠， 徐 勇

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 四川 瀘州 646000)

1000-4718(2012)03-0506-06

2011-07-14

2011-12-15

四川省杰出青年基金資助項目(No.2008-26-366)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30670980)

△通訊作者 Tel:0830-3165360 ；E-mail：xywyll@yahoo.com.cn

#現(xiàn)工作單位：湖南省馬王堆醫(yī)院 ##現(xiàn)工作單位：龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院

高糖作用的腎小球系膜細胞SnoN/Ski蛋白表達及泛素化降解*

南慶玲#， 陽 誠##， 徐 勇△

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 四川 瀘州 646000)

目的觀察高糖作用的大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN/Ski及泛素連接酶Arkadia的表達變化，初步探討SnoN/Ski泛素化降解在糖尿病腎病中的作用。方法將體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞分別設(shè)正常對照組 、高糖甲組(培養(yǎng)基含20 mmol/L葡萄糖)、高糖乙組(培養(yǎng)基含30 mmol/L葡萄糖)、高糖+MG132組(30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基中預(yù)先加入0.5 μmol/L特異性泛素蛋白酶體抑制劑MG132)和甘露醇組。用蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光染色-激光共聚焦顯微鏡檢測各組細胞SnoN/Ski及Arkadia蛋白的表達。結(jié)果(1)正常系膜細胞中SnoN/Ski蛋白大量表達，Arkadia蛋白表達較弱。(2)高糖作用后SnoN/Ski蛋白表達減弱，Arkadia蛋白表達增強(P<0.05)。(3)與高糖組比較，高糖加入MG132后SnoN/Ski蛋白表達增加，Arkadia蛋白表達減弱(P<0.01)。(4)甘露醇組與正常組比較SnoN/Ski及Arkadia蛋白表達均無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論(1)高糖可通過泛素蛋白酶體途徑降解SnoN/Ski蛋白致其低表達。(2)E3連接酶Arkadia參與了高糖誘導(dǎo)的SnoN/Ski的泛素化降解 。

SnoN/Ski； 泛素-蛋白酶體通路； Arkadia； 糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetic mellitus，DM)特有而常見的微血管并發(fā)癥，發(fā)病機制不清，高血糖所致各種生長因子可造成腎臟損害。在被激活的各種生長因子中, 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)是目前已知的致纖維化作用最強的多肽因子，它能誘導(dǎo)腎臟固有細胞表型轉(zhuǎn)化及促進細胞外基質(zhì)積聚，在腎小球硬化和腎小管-腎間質(zhì)纖維化進行性發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1-2]。SnoN/Ski是TGF-β通路的負性調(diào)節(jié)因子，通過各種不同的方式來拮抗Smad的作用從而阻斷Smad介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，它所介導(dǎo)的Smads轉(zhuǎn)錄活性的抑制是唯一發(fā)生于核內(nèi)的，且恰恰位于TGF-β靶基因轉(zhuǎn)錄之前，這決定了SnoN/Ski在調(diào)控TGF-β信號通路中的重要地位。SnoN/Ski在DN中的改變及機制目前尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在高糖作用的腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cells,GMCs)和糖尿病大鼠模型中，泛素蛋白酶體途徑活化，部分蛋白泛素化作用明顯增強，TGF-β/Smad信號上調(diào)[3]。為此，本研究將泛素蛋白酶體對蛋白質(zhì)的降解機制應(yīng)用到DN信號通路的研究中。首先將大鼠正常GMC進行體外培養(yǎng)，用高糖作為刺激因子，MG132作為泛素蛋白酶體通路阻斷劑，用蛋白免疫印跡(Western blotting)技術(shù)和免疫熒光染色-激光共聚焦顯微鏡檢測各組系膜細胞SnoN、Ski及Arkadia蛋白的表達，旨在從細胞信號角度探討泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)在高糖誘導(dǎo)系膜細胞TGF-β/Smad通路中的作用，為進一步闡明DN發(fā)生機制及其防治提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料和試劑

大鼠GMCs(HBZY-1細胞)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。兔抗大鼠SnoN多克隆抗體(ab58846)購自Abcam。小鼠抗大鼠Ski單克隆抗體(sc-33693)及山羊抗大鼠Arkadia多克隆抗體(sc-19242)購自Santa Cruz。MG132(proteasome抑制劑)購自Calbiochem。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及分組 GMC用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為5組：(1)正常對照組：培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖；(2)高糖甲組：培養(yǎng)基含20 mmol/L葡萄糖；(3)高糖乙組：培養(yǎng)基含30 mmol/L葡萄糖；(4)高糖+MG132組：30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基中預(yù)先加入0.5 μmol/L特異性泛素蛋白酶體抑制劑MG132;(5)甘露醇組：培養(yǎng)基含5.6 mmol/L的葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇，作為高糖乙組的滲透壓對照。

2.2Western blotting 以細胞裂解液提取各組干預(yù)后的細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。每泳道25 g蛋白上樣，行SDS-PAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。TBST洗滌，5%脫脂奶粉封閉。然后將膜放入稀釋的Ⅰ抗(SnoN 1∶400、β-actin 1∶4 000)，4 ℃孵育過夜。第2 d TBST沖洗后，加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ⅱ抗(稀釋倍數(shù)為1∶4 000)，37 ℃孵育1 h，TBST沖洗后ECL顯影曝光。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，設(shè)內(nèi)參照β-actin，計算各目標蛋白的相對含量。

2.3細胞免疫熒光染色(激光共聚焦顯微鏡觀察) 將各組干預(yù)后的細胞爬片用多聚甲醛固定，Triton打孔，血清封閉，然后加入Ⅰ抗(SnoN、Ski及Arkadia Ⅰ抗?jié)舛染鶠?∶50)，作用60 min， 4 ℃冰箱過夜(至少16 h)。用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。PBS洗滌后加入FITC標記的Ⅱ抗(稀釋比1∶50)，37 ℃水浴作用60 min，注意避光操作。再次洗滌后封片鏡檢，使用Leica DMIRE2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)對細胞的熒光分布及強度進行觀察。最后用Image-Pro Plus 6.0軟件對熒光強度進行半定量分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1高糖對腎小球系膜細胞SnoN表達的影響

1.1Western blotting檢測結(jié)果

1.1.1高糖作用不同時間后SnoN的表達 免疫印跡發(fā)光顯影后顯示，見圖1，各條泳道均在60 kD和36 kD處各出現(xiàn)1條帶，與預(yù)期的SnoN蛋白和內(nèi)參照GAPDH相吻合，說明兩者均為特異性蛋白條帶，其中各組GAPDH條帶的亮度基本一致。目的條帶中，高糖組的亮度較正常組減弱，且隨著時間的延長條帶的亮度逐漸減弱。

Figure 1. Western blotting detection of the expression of SnoN protein in GMCs of 30 mmol/L glucose group for different time.

圖130mmol/L葡萄糖作用不同時間GMCsSnoN蛋白的表達

在高糖作用的48 h內(nèi)，高糖可促進SnoN蛋白的表達下降，且隨著作用時間的延長，SnoN蛋白表達下降愈加明顯。與正常對照組相比，30 mmol/L葡萄糖濃度作用12 h SnoN蛋白表達下降12%，作用24 h SnoN蛋白表達下降42%，作用48 h SnoN蛋白表達下降53%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。這提示高糖促進SnoN蛋白的表達下降具有時間依賴性，且在48 h時下降效果尤為明顯。

表1 30 mmol/L葡萄糖作用不同時間后SnoN蛋白的表達

▲P<0.05vsnormal control group；**P<0.01vs30 mmol/L glucose group(12 h)；△P<0.05vs30 mmol/L glucose group(24 h).

1.1.2各組干預(yù)48 h SnoN的表達 免疫印跡發(fā)光顯影后顯示，見圖2，高糖組SnoN條帶的亮度較弱，且隨著濃度的增加亮度逐漸減弱。甘露醇組和高糖+MG132組亮度和正常組相似，均較高。

Figure 2. The expression of SnoN protein in GMCs of each group analysed by Western blotting(48 h).

圖2各組GMCsSnoN蛋白的表達(48h)

與正常組相比，20 mmol/L高糖甲組SnoN蛋白表達下降34%(P<0.01)，30 mmol/L高糖乙組SnoN蛋白表達下降54%(P<0.01)。提示高糖可促進SnoN蛋白的表達下降，且具有濃度依賴性。甘露醇組與正常組比較，SnoN蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與高糖乙組比較，高糖加入MG132后，系膜細胞SnoN蛋白的表達增加46%(P<0.01)。

甘露醇組與正常組比較，SnoN蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2免疫印跡檢測各組作用48hSnoN蛋白的表達

GroupSnoNproteinNormalcontrol1.858±0.17320mmol/Lglucose1.218±0.107▲▲30mmol/Lglucose0.850±0.141▲▲**30mmol/Lgluclose+MG1321.585±0.206△△Mannitol1.818±0.266△△

▲▲P<0.01vsnormal control group；**P<0.01vs20 mmol/L glucose group；△△P<0.01vs30 mmol/L glucose group.

1.2免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果 共聚焦顯微鏡下圖像可見，SnoN蛋白在正常對照組細胞中有大量表達，主要定位于胞漿，胞核中表達較少，見圖3A;高糖刺激后SnoN表達明顯減弱，見圖3B;加入MG132作用后，高糖組表達增強，見圖3C;甘露醇組表達較強，見圖3D。

Figure 3. Expression of SnoN protein in GMCs of each group (immunohistochemical staining,×600). A: normal control;B:30 mmol/L glucose;C: 30 mmol/L glucose and MG132;D: mannitol.

圖3各組系膜細胞中SnoN蛋白的表達

對熒光強度進行半定量分析的結(jié)果顯示，與正常對照組相比，30 mmol/L葡萄糖作用GMCs 48 h后SnoN蛋白表達下降54%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與高糖乙組比較，高糖加入MG132后，SnoN蛋白的表達增加83%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。甘露醇組與正常組比較，SnoN蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3免疫熒光技術(shù)檢測各組GMCs中SnoN蛋白的表達量

GroupSnoNproteinNormalcontrol1.777±0.10930mmol/Lglucose0.822±0.082▲▲30mmol/Lgluclose+MG1321.501±0.164**Mannitol1.746±0.130**

▲▲P<0.01vsnormal control group；**P<0.01vs30 mmol/L glucose group.

2高糖對腎小球系膜細胞Ski的表達影響

共聚焦顯微鏡圖像可見，正常系膜細胞中Ski主要在胞漿表達，胞核中表達很少，見圖4。熒光強度半定量分析結(jié)果顯示，在高糖作用的48 h內(nèi)，高糖可促進Ski蛋白的表達下降，且隨著作用時間的延長，Ski蛋白表達下降愈明顯。與正常對照組相比，30 mmol/L葡萄糖作用GMCs 12 h，細胞內(nèi)Ski蛋白表達降低37%，作用24 h Ski蛋白表達降低50%，作用48 h Ski蛋白表達降低56%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表4。

Figure 4. Expression of Ski protein in GMCs of each group (immunohistochemical staining,×600).A: normal control; B:20 mmol/L gluclose;C: 30 mmol/L gluclose (24 h); D: 30 mmol/L gluclose (48 h);E: 30 mmol/L gluclose and MG132; F: mannitol.

圖4各組系膜細胞中Ski蛋白的表達

表4 免疫熒光檢測30 mmol/L葡萄糖作用不同時間Ski蛋白的表達

▲▲P<0.01vsnormal control group；*P<0.05vs30 mmol/L glucose group (12 h).

作用48 h后各組熒光圖像進行半定量分析結(jié)果見表5。與正常對照組相比， 20 mmol/L高糖甲組Ski表達下降41%，30 mmol/L高糖乙組Ski表達下降55%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示高糖對促進Ski蛋白的表達下降作用具有一定的時間、濃度依賴性。甘露醇組與正常組比較，Ski蛋白的表達差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。與高糖乙組比較，高糖加入MG132后，系膜細胞內(nèi)Ski表達增加51%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3高糖對腎小球系膜細胞Arkadia表達的影響

正常對照組Arkadia蛋白表達較弱，主要定位于胞漿，見圖5A。高糖刺激后Arkadia表達明顯增強，見圖5B，加入MG132后，其表達較高糖組減弱，見圖5C。甘露醇組表達較弱，見圖5D。

表5免疫熒光檢測各組GMCs中Ski蛋白的表達量

GroupSkiproteinNormalcontrol1.494±0.12820mmol/Lglucose0.876±0.132▲▲30mmol/Lglucose0.671±0.127▲▲**30mmol/Lgluclose+MG1321.365±0.282△△Mannitol1.446±0.147△△

▲▲P<0.01vsnormal control group；**P<0.01vs20 mmol/L glucose group；△△P<0.01vs30 mmol/L glucose group.

與正常對照組相比，30 mmol/L葡萄糖濃度作用GMC 48 h Arkadia蛋白表達增加55%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與高糖組比較，高糖加入MG132后，Arkadia蛋白的表達降低27%(P<0.01)。甘露醇組與正常組比較，Arkadia蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

Figure 5. Expression of Arkadia protein in GMCs of each group (immunohistochemical staining,×600). A: normal control;B:30 mmol/L gluclose;C: 30 mmol/L gluclose and MG132;D: mannitol.

圖5各組系膜細胞中Arkadia蛋白的表達

表6免疫熒光技術(shù)檢測各組GMCsArkadia蛋白的表達

GroupArkadiaproteinNormalcontrol0.623±0.23430mmol/Lglucose0.963±0.149▲▲30mmol/Lgluclose+MG1320.702±0.235**Mannitol0.676±0.144**

▲▲P<0.01vsnormal control group；**P<0.01vs30 mmol/L glucose group.

討 論

SnoN/Ski作為Smad轉(zhuǎn)錄拮抗劑，它的表達水平在很大程度上影響TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)。多個研究表明[4-5]，在纖維化腎組織中, TGF-β的表達水平進行性顯著增加，而SnoN和Ski的蛋白水平進行性顯著減少。本實驗結(jié)果也顯示：在高糖培養(yǎng)的48h以內(nèi)，與正常對照組相比，高糖可促進SnoN/Ski蛋白表達下降，呈一定的時間、濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組比較，高糖加入特異性蛋白酶體抑制劑MG132后， SnoN/Ski蛋白表達明顯增加。甘露醇組與正常組比較，SnoN/Ski蛋白的表達無明顯差異，說明高糖對SnoN/Ski的作用與滲透壓無關(guān)。提示高糖所致的SnoN/Ski蛋白泛素化降解可能是糖尿病腎病TGF-β/Smads通路激活的新機制。

UPP對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)進行高效并高度選擇性、能量依賴性降解，能精確調(diào)控細胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)，進而影響細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、抗原呈遞、炎癥反應(yīng)及基因轉(zhuǎn)錄表達等[6-7]。尤其是通過降解細胞內(nèi)各信號通路的抑制因子或/和激活因子發(fā)揮著上調(diào)或下調(diào)作用[8]。而Arkadia作為泛素蛋白酶體系統(tǒng)中的一種E3泛素連接酶，對蛋白的泛素化降解具有相對的特異性和唯一性，它僅與抑制型Smads(如Smad7)及負性因子SnoN、Ski等發(fā)生強烈相互作用，對其它信號分子不產(chǎn)生降解作用，也不與TGF-β受體作用，對TGF-β/Smad信號通路的生物學(xué)效應(yīng)只起增強作用[9-10]。Liu等[11]的研究表明，Arkadia通過誘導(dǎo)Smad7的降解使在腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。李曉照[12-13]的研究也發(fā)現(xiàn)，在UUO大鼠腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病過程中，Arkadia-Smad7相互作用介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號通路正向調(diào)控作用可能促使腎小管間質(zhì)纖維化病變的發(fā)生和加重；在哮喘大鼠模型中，Arkadia可分別與SnoN、Ski和Smad7發(fā)生相互作用，在放大TGF-β信號促進氣道重塑形成中起關(guān)鍵作用。

目前對于Arkadia在DN中的研究較少，為了進一步明確Arkadia與SnoN/Ski泛素化的關(guān)系及在DN中的作用，本實驗首先用不同濃度高糖作用GMC，觀察高糖對SnoN/Ski及Arkadia蛋白表達的影響；然后用蛋白酶體抑制劑MG132特異性阻斷泛素蛋白酶體途徑，以觀察泛素化在高糖刺激的GMC中的變化。結(jié)果顯示：高糖刺激時Arkadia蛋白表達增加，SnoN/Ski蛋白表達下降；加入MG132后，Arkadia蛋白表達減弱，與此同時，SnoN/Ski蛋白的表達明顯增強。提示高糖時SnoN/Ski可能通過連接酶Arkadia進行泛素化降解。

鑒于SnoN/Ski對TGF-β信號通路負性調(diào)控的重要性，Arkadia介導(dǎo)的泛素化修飾對SnoN/Ski調(diào)控的有效性，以及MG132阻斷泛素化途徑的客觀性，我們認為：糖尿病時，高糖等致病因子可能通過Arkadia等的介導(dǎo)致SnoN/Ski蛋白泛素化降解增強、表達降低，不能有效抑制TGF-β的纖維化信號，使該通路持久活化，可能是糖尿病腎病發(fā)生的新機制。

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Ubiquitin-dependentdegradationofSnoN/Skiproteininglomerularmesangialcellsinducedbyhighglucose

NAN Qing-ling, YANG Cheng, XU Yong

(DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedHospital,LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China.E-mail:xywyll@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the protein expression of SnoN/Ski and ubiqutin ligase Arkadia in rat glomerular mesangial cells (GMCs) exposed to the high glucose.METHODSCultured rat glomerular mesangial HBZY-1 cells were divided into control group, 20 mmol/L glucose group, 30 mmol/L glucose group, 30 mmol/L glucose+MG132 group (culture medium containing 30 mmol/L glucose and 0.5 μmol/L specific proteasome inhibitor MG132), and mannitol group. The expression levels of SnoN, Ski and Arkadia were measured by Western blotting analysis, immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy.RESULTSIn control GMCs, the expression of SnoN/Ski was rich and Arkadia was weak. After stimulated with high glucose, the expression of SnoN/Ski was decreased and Arkadia was gradually increased (P<0.05). Compared with high glucose group, the levels of SnoN/Ski and Arkadia were mostly reverted by adding the proteasome inhibitor MG132 at concentration of 0.5 μmol/L (P<0.01). The expression levels of SnoN/Ski and Arkadia were not significantly changed in mannitol group in comparison with control group (P>0.05).CONCLUSIONHigh glucose decreases the expression of SnoN/Ski through ubiquitin-dependent degradation of SnoN/Ski. The degradation of SnoN/Ski mediated by Arkadia may play an important role in the pathogenesis of diabetic nephropathy.

SnoN/Ski; Ubiquitin-proteasome pathway; Arkadia; Diabetic nephropathies

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.021