胰腺癌神經(jīng)浸潤體外模型的構(gòu)建與觀察

安薇 李平 李桂香 吳紅玉 金晶 李兆申 賁其穩(wěn)

·論著·

胰腺癌神經(jīng)浸潤體外模型的構(gòu)建與觀察

安薇 李平 李桂香 吳紅玉 金晶 李兆申 賁其穩(wěn)

目的構(gòu)建胰腺癌神經(jīng)浸潤的體外模型，并對(duì)胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤現(xiàn)象進(jìn)行初步觀察。方法將胰腺癌Capan-2細(xì)胞與大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)置于Matrigel基質(zhì)膠中共培養(yǎng)，分別建立以觀察細(xì)胞集落面積(模型1)和觀察細(xì)胞遷移距離(模型2)為主的兩種模型。倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)突及細(xì)胞生長情況，利用圖像分析軟件Image pro plus對(duì)圖片進(jìn)行分析。結(jié)果共培養(yǎng)對(duì)神經(jīng)突起生長無顯著影響，無論是共培養(yǎng)還是單培養(yǎng)，DRG神經(jīng)突均向四周呈放射狀生長。培養(yǎng)模型中，Capan-2細(xì)胞朝向DRG方向生長遷移，接著包繞神經(jīng)突呈紡錘狀，并繼續(xù)向DRG爬行。在模型1的共培養(yǎng)組，Capan-2細(xì)胞第5天時(shí)細(xì)胞集落面積為(309.28±19.11)μm2，顯著大于單培養(yǎng)模型的(208.57±7.94)μm2(P<0.01)。在模型2的共培養(yǎng)組，Capan-2細(xì)胞第5天時(shí)向DRG方向遷移了(284.1±12.9)μm，而空白基質(zhì)膠一側(cè)，細(xì)胞遷移距離<150 μm，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了胰腺癌神經(jīng)浸潤體外模型，為后續(xù)研究打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

胰腺腫瘤； 神經(jīng)浸潤； 體外研究； 神經(jīng)節(jié)，脊； 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

胰腺癌外周神經(jīng)浸潤是其術(shù)后發(fā)生腹膜后轉(zhuǎn)移的重要原因[1]，也是獨(dú)立于其他因素之外影響患者預(yù)后的重要因素[2-3]。目前研究認(rèn)為，神經(jīng)浸潤是由神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境之間交互作用的結(jié)果，因此，建立類似神經(jīng)與癌細(xì)胞共同生存的微環(huán)境尤為重要。Matrigel基質(zhì)膠是源于Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤溶解的基底膜制劑，能為背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)和癌細(xì)胞共培養(yǎng)的三維培養(yǎng)體系提供類似體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)利用Matrigel基質(zhì)膠，通過DRG與胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建胰腺癌神經(jīng)浸潤的體外模型，并對(duì)癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材料和方法

一、Capan-2細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞系Capan-2由長海醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

二、DRG獲取

健康雄性SD大鼠，1～2周齡，清潔級(jí)，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。參照文獻(xiàn)[4]的方法獲取大鼠DRG，用無菌PBS清洗3次，置無血清培養(yǎng)基中4℃保存。

三、共培養(yǎng)模型建立

模型1：將Matrigel基質(zhì)膠(BD，USA)置于4℃冰箱溶化過夜，加入100 μl于6孔板孔中央，膠內(nèi)植入一枚大鼠DRG。取對(duì)數(shù)生長期Capan-2細(xì)胞，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸為1×104個(gè)/μl的細(xì)胞懸液。取10 μl的細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)懸液接種于DRG附近。上述操作于冰上進(jìn)行。隨后將6孔板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，加入3 ml RPMI-1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。采用同樣方法分別建立Capan-2細(xì)胞及DRG的單培養(yǎng)模型。

模型2：取10 μl細(xì)胞懸液加入40 μl Matrigel基質(zhì)膠中，輕輕混勻。在6孔板孔中央加入50 μl的細(xì)胞基質(zhì)膠混懸液，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3～5 min，在細(xì)胞旁0.5～0.8 mm處放置一枚大鼠DRG，并覆蓋50 μl Matrigel基質(zhì)膠，另一端則直接加50 μl Matrigel基質(zhì)膠。隨后將6孔板置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，加入3 ml RPMI-1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

上述模型在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，每隔1 d在倒置顯微鏡下觀察胰腺癌細(xì)胞的遷移、集落形成及DRG神經(jīng)突生長的情況并拍照，用專業(yè)圖像分析軟件Image pro plus6.0進(jìn)行分析。參照Ayala等[5]方法，分別在培養(yǎng)第3及第5天于40倍鏡下計(jì)算DRG發(fā)出的神經(jīng)突面積，選定區(qū)域細(xì)胞集落面積及細(xì)胞遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、大鼠DRG的獲取

大鼠DRG位于脊髓側(cè)部脊神經(jīng)后根出椎管處，附著于脊神經(jīng)后根，大小約1～2 mm，呈米白色，類圓形，表面光滑(圖1)。

圖1 大鼠DRG的獲取

二、體外DRG的神經(jīng)突生長

DRG神經(jīng)突的生長無論共培養(yǎng)還是單培養(yǎng)，均呈三維放射狀生長，在下方的神經(jīng)突可貼壁生長。培養(yǎng)第3、5天時(shí)，單培養(yǎng)組的神經(jīng)突面積分別為(112.3±18.96)μm2和(300.86±17.98)μm2(圖2a)；共培養(yǎng)組面積分別為(115.62±10.55)μm2和(312.20±17.28)μm2，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.808、0.475)。

圖2DRG單培養(yǎng)(a)組的DRG及Capan-2單培養(yǎng)(b)、共培養(yǎng)中單純基質(zhì)膠一側(cè)的Capan-2細(xì)胞培養(yǎng)第1(1)、3(2)、5(3)天時(shí)的生長情況(×100)

三、體外Capan-2細(xì)胞的增殖

在模型1(圖3上)的共培養(yǎng)組，Capan-2細(xì)胞于第3、5天時(shí)形成的細(xì)胞集落面積分別為(183.61±13.77)、(309.28±19.11)μm2，而單培養(yǎng)模型中Capan-2細(xì)胞于第3、5天時(shí)形成的細(xì)胞集落面積分別為(116.1±11.88)、(208.57±7.94)μm2(圖2b)，顯著小于共培養(yǎng)組(P值均<0.01)。Capan-2細(xì)胞朝向DRG方向生長遷移，接著包繞神經(jīng)突呈紡錘狀并繼續(xù)向神經(jīng)節(jié)體爬行(圖4a)。

在模型2(圖3下)的共培養(yǎng)組，靠近DRG一側(cè)Capan-2細(xì)胞貼壁生長，胞體變長，并向DRG方向遷移，當(dāng)與神經(jīng)突接觸后則沿著神經(jīng)突生長(圖4b)，第5天時(shí)細(xì)胞前端較第1天約遷移了(284.1±12.9)μm；而空白基質(zhì)膠一側(cè)，細(xì)胞也貼壁生長，但胞體未延伸變長，遷移距離均<150 μm(圖2c)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3共培養(yǎng)模型1(上)、模型2(下)培養(yǎng)第1(a)、5(b)天時(shí)的Capan-2細(xì)胞與DRG的生長變化

圖4Capan-2細(xì)胞與DRG的生長(a)及遷移(b)(×200)

討 論

早期研究認(rèn)為，胰腺癌細(xì)胞主要通過神經(jīng)周圍及神經(jīng)束膜內(nèi)的淋巴系統(tǒng)侵犯神經(jīng)[6]，然而通過病理對(duì)比發(fā)現(xiàn)許多患者有神經(jīng)浸潤但并無淋巴道轉(zhuǎn)移。隨后，又提出神經(jīng)間隙學(xué)說，即癌細(xì)胞沿阻力小的通路侵襲神經(jīng)。目前的研究結(jié)果更傾向于癌細(xì)胞與神經(jīng)相互作用及腫瘤微環(huán)境的變化導(dǎo)致神經(jīng)浸潤的發(fā)生[7]。但由于早期的研究缺乏合適的模型反映腫瘤與神經(jīng)相互作用的微環(huán)境，因而阻礙了神經(jīng)浸潤機(jī)制的研究進(jìn)展。1997年Tonge等[4]成功應(yīng)用基質(zhì)膠在體外培育了大鼠DRG，并記錄了其生長的特點(diǎn)，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。Ayala等[5]將大鼠DRG與前列腺癌DU-145細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠中共培養(yǎng)，構(gòu)建了新的體外神經(jīng)浸潤模型，觀察到癌細(xì)胞與神經(jīng)突互逆生長，類似于組織切片所見的神經(jīng)浸潤過程，提示生長活躍的神經(jīng)組織可能通過某種方式促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤。2007年Dai等[8]將此模型應(yīng)用于胰腺癌神經(jīng)浸潤的研究，證實(shí)了神經(jīng)組織、癌細(xì)胞及周圍環(huán)境之間確實(shí)存在交互作用。最近，有研究者在此基礎(chǔ)上分別建立了胰腺癌細(xì)胞與DRG及與腸肌叢神經(jīng)細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型，也觀察到神經(jīng)共培養(yǎng)的環(huán)境改變了胰腺癌T3M4細(xì)胞的生物學(xué)行為[9]。

本實(shí)驗(yàn)建立了胰腺癌Capan-2與DRG體外共培養(yǎng)的兩種模型，結(jié)果顯示該兩種模型均出現(xiàn)Capan-2細(xì)胞的嗜神經(jīng)性及神經(jīng)浸潤的主動(dòng)性和連續(xù)性，并觀察到共培養(yǎng)的環(huán)境能促進(jìn)細(xì)胞增殖，然而機(jī)制尚不明確，推測(cè)神經(jīng)組織分泌的生長因子可能起到一定作用[8]。但本研究未發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)對(duì)神經(jīng)突的生長有明顯的影響。Ceyhan等[9]研究也未提及共培養(yǎng)的環(huán)境對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生的影響。Ayala等[5]認(rèn)為，在癌細(xì)胞與DRG未接觸前，共培養(yǎng)的神經(jīng)突較單培養(yǎng)生長快，但共培養(yǎng)到第3天，二者接觸后就產(chǎn)生了抑制，使得神經(jīng)突生長相對(duì)緩慢。

本實(shí)驗(yàn)兩種模型均簡單、易操作，且費(fèi)用較低，能連續(xù)觀察，為進(jìn)一步研究胰腺癌外周神經(jīng)浸潤的作用機(jī)制提供較好的模型。

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Constructionofmodelsforperineuralinvasioninpancreaticcancer

ANWei,LIPing,LIGui-xiang,WUHong-yu,JINJing,LIZhao-shen,BENQi-wen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

BENQi-wen,Email:benqw0908@126.com

ObjectiveTo establishinvitromodel for perineural invasion (PNI) of pancreatic cancer, and observe the process of PNI.MethodsMouse dorsal root ganglia (DRG) and pancreatic cancer Capan-2 cell line were co-cultured in Matrigel matrix. Two models were constructed: model 1 for observing areas of cell colonies and model 2 for observing distance of cell migration. Neurite outgrowth and cell colony growth were observed by invert microscope, images were analyzed by using Image pro plus software.ResultsNeurite outgrowth was not affected by co-culture. DRG neurite appeared radial growth under either co-culture or single culture. It was observed that Capan-2 cell could migrate to DRG, and grows around the nerve fiber as spindle-shaped, then continue to migrate to DRG. At the 5th day, in the co-culture group of model 1, the colony area was (309.28±19.11) μm2, which was significantly bigger than that in single culture model [(208.57±7.94) μm2,P<0.01]. At the 5 th day, in the co-culture group of model 2, Capan-2 migrated (284.1±12.9) μm to DRG, while in the side of blank Matrigel, cell migrated less than 150 μm, the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionsTheinvitromodels for perineural invasion in pancreatic cancer were constructed successfully, which lay a good foundation for future studies.

Pancreatic neoplasm; Perineural invasion;Invitro; Ganglia,spinal; Theoretical models

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.005

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(8107205)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

賁其穩(wěn)，Email：benqw0908@126.com

2012-03-31)

(本文編輯：呂芳萍)