舒 慧，魏 蕾

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430071)

酗酒易引起酒精性肝病，包括肝炎、脂肪肝和肝硬化，嚴(yán)重危害身體健康。近年來，酒精性肝病的發(fā)病率明顯上升［1］，受到廣泛的關(guān)注和重視。目前對該病的治療仍以戒酒、營養(yǎng)支持為主，西醫(yī)藥未有突破性進(jìn)展，而多應(yīng)用中醫(yī)藥治療。中藥黃芪具有補(bǔ)氣固表功效，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)造血功能、改善物質(zhì)代謝、抗應(yīng)激、延緩衰老、保肝和抗?jié)兊茸饔貌⒁褟V泛應(yīng)用于臨床［2］。文獻(xiàn)報道，氧化應(yīng)激是酒精性肝損傷發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一［3］，本實驗觀察黃芪對急性酒精性肝損傷模型小鼠氧化應(yīng)激的影響，探討黃芪的護(hù)肝作用機(jī)制，為本藥臨床應(yīng)用于預(yù)防酒精性肝病提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

①黃芪口服液的制備:黃芪購自湖北省咸寧市溫泉輔仁堂藥店，按文獻(xiàn)［4］法制成每毫升相當(dāng)原生藥1g(1g/ml)的濃縮口服液，4℃保存。②實驗用酒:使用市售紅星牌二鍋頭酒，酒精度55%(v/v)，北京釀酒總廠出品，臨用前用雙蒸水稀釋成50%酒精濃度。③試劑與儀器:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號20100528)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號20100516)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20100425)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(批號20100421)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號20100419)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20100313)、總蛋白(TP)試劑盒(批號20100528)由南京建成生物工程研究所提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。722型光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗動物

昆明種雄性小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，清潔級，由湖北醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(合格證號:00011585)。動物實驗室條件:室溫(22±2)℃，濕度50% ～70%。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組給藥及造模

60只小鼠隨機(jī)分成4組，即正常組、模型組、黃芪低、高(0.5g/kg，1.0g/kg)劑量組，每組 15只，分別灌胃等容積生理鹽水和黃芪口服液，1次/d，連續(xù)7d。末次給藥后，除正常組外，其他各組灌胃50%白酒0.2ml/10g，1次/d，共3次，制備小鼠急性酒精性肝損傷模型。

1.3.2 指標(biāo)測定

實驗結(jié)束后，禁食12h(不禁水)，將各組存活小鼠摘眼球采血，肝素抗凝，3000r/min離心10min，制備血漿。然后脫臼處死，取各組小鼠肝臟稱濕重，并用生理鹽水制備10%肝組織勻漿。按試劑盒說明書方法，分別測定血漿ALT和AST活性(賴氏法)，并測定肝組織SOD和GSH-PX活性及MDA、GSH和總蛋白(考馬斯亮藍(lán)法)的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用s表示，組間顯著性差異性比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常組小鼠毛發(fā)光澤，動作自如，反應(yīng)靈敏，15只全部存活;模型組小鼠明顯嗜睡、倦怠、存活8只;黃芪低、高劑量組上述癥狀較模型組輕，分別存活8只和10只。χ2檢驗，4組間小鼠存活率無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 黃芪對酒精性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響

見表1、表2和表3。

表1 4組小鼠血漿ALT和AST活性的比較(s，U/賴氏單位)

表1 4組小鼠血漿ALT和AST活性的比較(s，U/賴氏單位)

與正常組比較，△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;與黃芪低劑量組比較，#P＜0.05、##P＜0.01

36.16±15.12 60.25±5.72模型組 8 — 96.90±29.71△ 158.52±11.74△黃芪低劑量組 8 0.5 72.74±10.60△＊ 89.88±14.87△＊＊黃芪高劑量組 10 1.0 52.34±19.31＊＊# 65.43±6.19＊＊##ALT AST正常組 15 —組別 n 劑量(g/kg)

表2 4組小鼠肝組織SOD和GSH-PX活性的比較(s，)

表2 4組小鼠肝組織SOD和GSH-PX活性的比較(s，)

與正常組比較，△P＜0.05、△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.01;與黃芪低劑量組比較，#P＜0.05

組別 n 劑量(g/kg)SOD(nU/mg prot)GSH-PX(U/mg prot)48.63±2.26 302.17±19.45模型組 8 — 41.78±2.13△△ 190.21±16.50△△黃芪低劑量組 8 0.5 45.83±2.11△△＊ 236.67±11.18△△＊黃芪高劑量組 10 1.0 46.75±2.15△＊ 259.35±17.83△△＊#正常組 15 —

表3 4組小鼠肝組織GSH和MDA含量的比較(s，nmol/mg prot)

表3 4組小鼠肝組織GSH和MDA含量的比較(s，nmol/mg prot)

與模型組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;與正常組比較，△P＜0.05、△△P＜0.05;與黃芪低劑量組比較，#P＜0.05

組別 n 劑量(g/kg)2.10±0.21 41.36±2.51模型 8 — 4.15±1.26△△ 33.54±3.23△△黃芪低劑量 8 0.5 2.81±0.71△＊ 37.61±2.74△△＊黃芪高劑量 10 1.0 2.69±0.78△＊＊ 41.92±3.65＊＊#MDA GSH正常 15 —

3 討論

眾所周知:酗酒易傷肝。為了探討中藥黃芪預(yù)防酒精性肝損傷的作用機(jī)制，本文采用白酒灌胃建立酒精性肝損傷的小鼠動物模型［5］，因ALT和AST是肝細(xì)胞內(nèi)的主要功能酶，在肝組織損傷及壞死時，肝細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)被破壞，膜的流動性失常，酶從細(xì)胞內(nèi)漏出入血，故檢測造模后小鼠血中ALT和AST活性的高低可判斷其肝細(xì)胞損傷的程度［6］，本文模型組小鼠血漿ALT和AST活性顯著高于正常組，表明酒精性肝損傷的小鼠動物模型制備成功。有文獻(xiàn)報道［7，8］，酒精性肝損傷的致病機(jī)制與氧化應(yīng)激關(guān)系緊密，氧化應(yīng)激是指活性氧自由基導(dǎo)致機(jī)體組織的氧化損傷。在生理條件下，機(jī)體細(xì)胞經(jīng)呼吸獲取氧，其中98%的氧與細(xì)胞器內(nèi)的葡萄糖和脂肪相結(jié)合，轉(zhuǎn)化為能量，以滿足細(xì)胞活動的需要，另外2%的氧則轉(zhuǎn)化成氧自由基。氧自由基主要有活性氧(O-2)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等。氧自由基的過氧化殺傷，主要是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，破壞線粒體，斷絕細(xì)胞的能源，毀壞溶酶體，使細(xì)胞自溶［9］。一次性大量或長期過量飲酒，約90%酒精(主要成分是乙醇)在肝臟內(nèi)氧化，除少量乙醇可在乙醇脫氫酶(ADH)和醛脫氫酶(ALDH)的催化下代謝生成二氧化碳和水排出體外，大量乙醇在ADH的催化下氧化轉(zhuǎn)變成乙醛。乙醛的毒性很強(qiáng)，與肝臟毒性密切相關(guān)，乙醛可通過黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變成超氧化物和氧自由基，乙醇還能誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞色素P450酶活性增高，產(chǎn)生大量的活性氧簇，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，破壞肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成肝損傷［10］;MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中不飽和脂肪酸分解釋放出的反應(yīng)性醛，是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致細(xì)胞腫脹、壞死，故檢測MDA含量的高低可反映肝臟損傷的程度［11］。機(jī)體存在著抗氧化系統(tǒng)，一類是酶系統(tǒng)，包括SOD、CAT、GSH-PX等;另一類是非酶系統(tǒng)，主要有GSH、維生素C和E等。生理狀態(tài)下，體內(nèi)這些抗氧化系統(tǒng)可以及時清除氧自由基，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧自由基的氧化損傷，但如氧自由基生成過多，超過了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，導(dǎo)致氧自由基過剩而蓄積，破壞了氧化/抗氧化的動態(tài)平衡，組織細(xì)胞遭受明顯的損傷和破壞，使機(jī)體病變及惡化，故檢測抗氧化系統(tǒng)的酶活性及GSH的含量變化亦可反映組織抗氧化應(yīng)激能力的高低［12］。本實驗結(jié)果顯示:模型組小鼠MDA顯著高于正常組，而 SOD、GSH-PX和 GSH顯著低于正常組，表明小鼠急性酒精性肝損傷時肝臟組織存在著明顯的氧化應(yīng)激;中藥黃芪可顯著降低血漿ALT和AST活性及肝組織中MDA含量;提高肝組織SOD和GSH-PX的活性和GSH含量;表明黃芪具有明顯的減輕酒精性肝損傷作用，機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)，而且高劑量黃芪組GSH-PX活性和GSH含量明顯高于其低劑量組，呈現(xiàn)量效關(guān)系。本文為黃芪預(yù)防酒精性肝損傷及其機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了實驗依據(jù)。

［1］邱德凱.重視對酒精性肝病的防治［J］.中華消化雜志，1993，13(3):126

［2］候家玉，方泰恵.中藥藥理學(xué)［M］.第2版.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2007:218

［3］黃梅芳，朱尤慶.酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)新知雜志，2003，13(2):104

［4］李儀奎.中藥藥理實驗方法學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991:36

［5］趙敏，楊杏芳，黃俊明，等.小鼠酒精性肝損傷模型的研究［J］.衛(wèi)生研究，2005，34(1):121

［6］王金萍，曾明.可舒膠囊對小鼠酒精性肝損傷的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2004，10(6):64

［7］陳慧敏，高南南.中藥抗氧化作用治療酒精性肝損傷的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(7):912

［9］樓宜嘉，朱依諄.藥物毒理學(xué)［M］.第2版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:104

［10］李東良，郭紅哲，楊才生，等.大鼠酒精性肝損傷模型的建立及病理學(xué)觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2000，10(2):30

［11］Koruk K，Taysi S，Savas MC，et al.Oxidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steato-hepatitis［J］.Acta Clin Lab Sci，2004，34:57

［12］Lebel CP，Bondy SC.Oxidative damage and cerebral aging［J］.Progress In Neurobiology，1992，38:601