王明勇 李 燕 宋淑敏 彭 強(qiáng)▲

1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科，四川瀘州 646000

人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)

王明勇1李 燕1宋淑敏2彭 強(qiáng)2▲

1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科，四川瀘州 646000

目的 從人臍帶血中分離內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs），建立人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，為實現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植及實驗研究提供足量的細(xì)胞來源。 方法 采用密度梯度離心法分離人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞，在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀、免疫組化和免疫熒光鑒定EPCs。 結(jié)果 臍帶血單個核細(xì)胞在經(jīng)EGM-2培養(yǎng)過程中出現(xiàn)梭形貼壁和鋪路石樣等形態(tài)；1周后既分化成EPCs，細(xì)胞免疫熒光CD133染色率在培養(yǎng)第7天為（67.2±2.12）%，免疫組化CD34染色率為（89.67±2.05）%，流式細(xì)胞儀鑒定該種細(xì)胞CD133與KDR的雙陽性率達(dá)87.8%?？纱_定該細(xì)胞為EPSc。 結(jié)論 采用本培養(yǎng)方法可獲得良好的內(nèi)皮祖細(xì)胞用于實驗研究。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；單個核細(xì)胞；人臍血；內(nèi)皮祖細(xì)胞

自1997年Asahara等[1]首次在成人外周血分離到循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）以來，此后又陸續(xù)在骨髓、臍帶血和其他軟體組織中發(fā)現(xiàn)EPCs[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞是來源于骨髓、外周血及臍帶血和其他軟體組織在外周血中循環(huán)，并能增殖分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞的一類前體細(xì)胞[3]。從臍帶血中分離獲取EPCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，較從骨髓、外周血和其他軟體組織獲取EPCs的量更多，損傷和風(fēng)險更小，雖然從外周血中分離EPCs也很方便，但其含量僅為從臍帶血中分離EPCs量的十分之一[4-7]。本實驗通過密度梯度離心得到單個核細(xì)胞后，通過添加一些細(xì)胞因子進(jìn)行體外培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)和促進(jìn)EPCs的分化，以獲得足夠的EPCs用于實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Hv-qapue，密度1.077 g/mL，天津市灝洋生物制品有限公司）；EGM-2培養(yǎng)基 （Lonza，美國）；胎牛血清（Hyclone，美國）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 （bFGF）和胰島素樣生長因子（IGF-1）均為美國Peprotech公司產(chǎn)品；纖維連接蛋白（FN，Sigma，美國）；兔抗人 CD133 單克隆抗體（Santacruz，美國）；鼠抗人CD34（epitomics，美國）；FITC標(biāo)記鼠抗人單克隆血管內(nèi)皮因子受體-2（VEGFR-2）（KDR）抗體，PCY 標(biāo)記鼠抗人CD133（Becman Coulter，美國）。X-60倒置相差顯微鏡（Nikon，日本）；AX70 熒光顯微鏡及圖像采集儀（Olympus，日本）；流式細(xì)胞儀（Becman Coulter，美國）。

1.2 方法

1.2.1 臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離 無菌條件下取正常剖宮產(chǎn)胎盤中的臍帶血50 mL（均簽署知情同意書并獲我院倫理委員會同意）。臍血中加入肝素（20 U/mL）抗凝，室溫靜置30～60 min。盡量吸取上清液到含有5 mL PBS緩沖液的試管中混勻；每個10 mL管中加入淋巴細(xì)胞分離液2 mL，然后加入混勻的臍血上清液4 mL；將試管放入水平離心機(jī)，2 000 r/min離心20 min；吸取呈乳白色的第2層細(xì)胞（單核細(xì)胞層）加入到含4 mL PBS液中混勻，1 200 r/min離心10 min；棄上清液，加入3 mL PBS液，混勻沉淀，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入適量的培養(yǎng)基 （EGM-2+20%胎牛血清+50 ng/mL VEGF+20 ng/mL bFG F+20 ng/mL IGF-1）吹打混勻。

1.2.2 臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng) 分離的單核細(xì)胞以1×105/cm2接種于纖維連接蛋白包被的12.5 mL培養(yǎng)瓶中；37℃、5%CO2、飽和濕度中培養(yǎng)；第3天半量換液，此后每2～3 d全量換液1次。

1.2.3 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察：前2 d靜置培養(yǎng)細(xì)胞，從第3天開始觀察。②免疫細(xì)胞化學(xué)染色：用0.02%EDTA消化培養(yǎng)7 d細(xì)胞，制成細(xì)胞涂片，采用SABC法，對細(xì)胞涂片的CD34進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，PBS液代替一抗作陰性對照，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為CD34陽性細(xì)胞。③免疫熒光染色：用0.02%EDTA消化培養(yǎng)7 d細(xì)胞，制成細(xì)胞涂片，細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，10%BSA封閉后，加入兔抗人CD133單克隆抗體（1∶100），陰性對照只加血清，37℃孵育60 min，PBS洗滌，加入FITC標(biāo)記的熒光素二抗（1∶50），37℃孵育 30 min，PBS 洗滌，干燥，封片，熒光顯微鏡觀察，顯示綠色熒光的細(xì)胞為CD133陽性細(xì)胞。④流式細(xì)胞檢測：用0.02%EDTA消化培養(yǎng)7 d細(xì)胞，制成1×106/L細(xì)胞懸液，分別加入FITC標(biāo)記鼠抗人單克隆血管內(nèi)皮因子受體-2（VEGFR-2）（KDR）抗體，PCY 標(biāo)記鼠抗人 CD133 抗體各20 μL避光室溫反應(yīng)30 min，然后上機(jī)檢測，分析KDR和CD133共表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在培養(yǎng)第3天可見約40%貼壁細(xì)胞為梭型；第4～5天貼壁細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞集落，周圍細(xì)胞以集落為中心，呈發(fā)芽式向外生長，周圍為呈放射狀分布的梭形細(xì)胞（圖1）；8～10 d出現(xiàn)“鋪路石樣”形似鵝卵石的單層細(xì)胞（圖2）。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

CD34免疫組化染色顯示（89.67±2.05）%培養(yǎng)7 d細(xì)胞為陽性。

2.3 免疫熒光染色

CD133免疫熒光染色顯示（67.2±2.12）%培養(yǎng)7 d細(xì)胞為陽性。

2.4 流式細(xì)胞檢測

流式細(xì)胞分析培養(yǎng)7 d細(xì)胞KDR和CD133的表達(dá)率共達(dá)87.8%。

3 討論

有研究認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）、胰島素樣生長因子（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）對內(nèi)皮祖細(xì)胞有調(diào)控作用，能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外生長[8-9]。這些生長因子用于培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的使用劑量和使用的種類，各個實驗室各不相同，本實驗采用3種生長因子進(jìn)行體外內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)：VEGF使用濃度為50 ng/mL，bFGF為 20 ng/mL，IGF-1為 20 ng/mL。

體外分離內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法主要有免疫磁珠、流式細(xì)胞術(shù)和密度梯度離心法，前兩種雖然可獲得高純度的細(xì)胞，但其回收內(nèi)皮祖細(xì)胞的量少且操作復(fù)雜，費用昂貴。通過預(yù)試驗我們對采取經(jīng)過靜置30～60 min的抗凝臍血上清液 （血漿）和采用抗凝臍血與PBS緩沖液1∶1稀釋后的血液分別用密度梯度離心法獲得的單個核細(xì)胞通過顯微鏡觀察比較，發(fā)現(xiàn)用靜置臍血血漿分離獲得的單個核細(xì)胞中的紅細(xì)胞含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于用PBS緩沖液與臍血 1∶1稀釋后的血液分離獲得的單個核細(xì)胞中的紅細(xì)胞含量，且用靜置臍血血漿分離獲得的單個核細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁情況比用PBS緩沖液與臍血 1∶1稀釋后的血液分離獲得的單個核細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)的貼壁情況要好。因此，本實驗采用密度梯度離心法從靜置30～60 min的抗凝臍血上清液 （血漿）中獲得單個核細(xì)胞用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有：一種方法是將獲得的單個核細(xì)胞接種到預(yù)先鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，24 h后將未貼壁的細(xì)胞重新接種到新的鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)[1]；另一種方法是將單個核細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4 d后棄掉未貼壁的細(xì)胞，留下的貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)[10]；還有一種是把單個核細(xì)胞接種到鋪有Ⅰ型膠原的培養(yǎng)板中，然后棄掉未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)[11]。纖維連接蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的黏附，并且與VEGF協(xié)同可提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和分化[12]，因此本實驗采用的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法是將獲得的單個核細(xì)胞接種到鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)3 d后棄去未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

內(nèi)皮祖細(xì)胞的的鑒定觀點不一。有人把表達(dá)CD34和KDR 的認(rèn)為 EPCs[1]；有些學(xué)者認(rèn)為 CD34、CD133、KDR 是EPCs特征性標(biāo)志[13]；也有學(xué)者把EPCs分為兩類，早期EPCs（CD34+、CD133+、KDR+），晚期 EPCs（CD34+、CD133－、KDR+）[14-16]。

通過對本實驗培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞免疫熒光CD133染色率在培養(yǎng)第7天為 （67.2±2.12）%，免疫組化CD34染色率在培養(yǎng)第7天為（89.67±2.05）%，流式細(xì)胞儀鑒定該種細(xì)胞在培養(yǎng)第7天CD133與KDR的雙陽性率達(dá)87.8%?？纱_定為EPCs，采用本方法可獲得良好的內(nèi)皮祖細(xì)胞用于實驗研究。

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Cultivation in vitro of people umbilical cord blood endothelial progenitor cells

WAMG Mingyong1LI Yan1SONG Shumin2PENG Qiang2▲
1.Medical Experiment Center,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Sichuan Province,Luzhou 646000,China;2.Department of Pediatric Surgery,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Sichuan Province,Luzhou 646000,China

Objective To establish a method of endothelial progenitor cells isolated from human umbilical cord blood in vitro,and to provide a sufficient amount of source for endothelial progenitor cell transplantation and experimental study.Methods Isolate from human umbilical cord blood endothelial progenitor cells with density gradient centrifugation,and culture in EGM-2 medium.EPCs were identificatd by flow cytometry and immunofluorescence.Results The cells cultured in EGM-2 were displayed spindle-shaped and cobble-stone morphology,and differentiated into EPCs a week later.The rate of CD133 immunofluorescence staining was(67.2±2.12)%on seven days.The rate of CD34 Immunohistochemical staining was(89.67±2.05)%on seven days.The double positive rate of CD133 and KDR was 87.8%in these cells.It could determine that the cell was EPSc.Conclusion We can obtain available endothelial progenitor cells using this culture method for experimental research.

Cell culture technology;Mononuclear cells;Human umbilical cord blood;Endothelial progenitor cells

R329.23

C

1673-7210（2012）05（a）-0032-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（30700876）；四川省教育廳資助項目（2006B026）。

▲通訊作者

2012-02-20 本文編輯：馮 婕）