曹志然，王永麗，戎瑞雪，王 蓓，王 海

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，河北保定 071000)

牛耳楓(Daphniphyllum calycinum Benth)是交讓木科(Daphniphyllaceae)交讓木屬(Daphniphyllum)植物，以根、葉入藥，其味苦澀，其功效為清熱解毒，活血舒筋。牛耳楓的葉和種子中均含有生物堿，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、形式多變，目前有關(guān)牛耳楓生物堿藥理作用的研究主要集中在抗膽堿酯酶活性及殺蟲作用方面，而對(duì)于其在抗腫瘤方面的研究報(bào)道甚少［1-2］。本課題組采用各種色譜方法從牛耳楓莖葉乙醇浸提物中分離提取到12種生物堿，采用MTT體外抗腫瘤活性的篩選發(fā)現(xiàn)生物堿F21在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞株(HepG-2)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U-251)和人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)等均具有一定的抑制作用，其中對(duì)HepG-2的抑制作用最強(qiáng)。通過(guò)波譜技術(shù)及理化性質(zhì)鑒定 F21化學(xué)結(jié)構(gòu)與 deoxycalyciphylline B相似［3］。本研究選擇最敏感的HepG-2作為研究對(duì)象，通過(guò)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、瓊脂糖凝膠DNA電泳分析、膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染流式細(xì)胞術(shù)以及胱天蛋白酶抑制劑阻斷實(shí)驗(yàn)等手段研究F21抗HepG-2的作用及作用機(jī)制，為該化合物的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑及儀器

F21是從牛耳楓的莖葉乙醇浸提物中采用正相硅膠，反相材料(C18，MCI)以及凝膠(Sephadex LH-20，Toyopearl HW-40C)分離得到，獲取率為1.6 mg·kg-1，并運(yùn)用薄層色譜及層析法純化，其純度為99%;HepG-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院藥物研究所;RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;1∶250胰蛋白酶購(gòu)自北京Solarbio公司;磷酸鹽緩沖液PBS購(gòu)自北京金杉金橋生物技術(shù)有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Amresco公司;二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自北京Solarbio公司;瑞姬氏染料購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒、DNA標(biāo)志物(BeyoRed)、胱天蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK和星形孢菌素(staurosporine，STS)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;PI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90)，上海力申科學(xué)儀器有限公司;倒置顯微鏡(CKX41SF)，日本Olympus Corporation;ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELISA Reader)，美國(guó)寶特有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司;DYY-11B電泳儀，北京市六一儀器廠;流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD FACScalibur;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含10%熱滅活胎牛血清、0.2%NaHCO3、青霉素 100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1)，在 37℃、飽和濕度、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到70% ～80%時(shí)，用胰酶2.5 g·L-1消化成單個(gè)細(xì)胞接種傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)HepG-2細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，制備2×107L-1單細(xì)胞懸液，以每孔90μl接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后按照分組分別加入10μl待測(cè)樣品，F(xiàn)21終濃度分別為100，50，25，12.5 和 6.25 mg·L-1;溶劑對(duì)照組每孔加10μl與待測(cè)樣品相應(yīng)濃度DMSO的培養(yǎng)液，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每塊板均設(shè)3個(gè)空白對(duì)照孔(僅加培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞)。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于20，44和 68 h取出培養(yǎng)板，每孔加 10μl MTT 10 g·L-1，4 h 后終止培養(yǎng)，棄上清，加 DMSO 100 μl振蕩5 min待結(jié)晶物充分溶解后，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(absorbance，A)，計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率(IR)，IR(%)=(1-A藥物/A溶劑對(duì)照) ×100%。改良寇氏法計(jì)算半數(shù)抑制濃度［4］。

另按每孔8×103個(gè)HepG-2細(xì)胞接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)正常對(duì)照組、STS50 mol·L-1組、STS+Z-VAD-FMK 組、F21 10 mg·L-1組、F21 10 mg·L-1+Z-VAD-FMK 20 μmol·L-1組、F21 30 mg·L-1組及 F21 30 mg·L-1+Z-VAD-FMK 20 μmol·L-1組，作用 48 h。每個(gè)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 瑞姬氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1，接種于蓋玻片上;37℃恒溫恒濕、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后，F(xiàn)21組換以含終濃度為10，30和100 mg·L-1的 RPMI 1640培養(yǎng)液，正常對(duì)照組加入等體積 RPMI 1640完全培養(yǎng)液，分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h;瑞姬氏染色并于光鏡下觀察。

1.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳

分別取l×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫恒濕、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h;棄上清液，按照分組分別加入含F(xiàn)21 10，30和100 mg·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)液，正常對(duì)照組加等體積RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h;細(xì)胞收集后按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA抽提和電泳。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG-2細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108L-1，置于37℃恒溫恒濕、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h;按照分組分別加入含 F21 10，30和100 mg·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)液，正常對(duì)照組只加入RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞、PBS緩沖液洗滌后，F(xiàn)ITC-Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 F21對(duì)HepG-2細(xì)胞存活的影響

表1結(jié)果顯示，F(xiàn)21對(duì)人腫瘤細(xì)胞HepG-2有顯著的抑制作用，且其抑制作用具有較好的時(shí)效(F=65.59，P ＜0.05)和量效(F=232.39，P ＜ 0.05)關(guān)系，在 24，48 和 72 h 的 IC50值分別為 5.3 ±0.1，1.3 ±0.1和(0.13 ±0.1)mg·L-1。

Tab.1 Effect of F21 on HepG-2 cell porliferation

2.2 F21對(duì)HepG-2細(xì)胞形態(tài)的影響

正常對(duì)照組細(xì)胞膜完整，胞漿呈藍(lán)色，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核完整，染成紫紅色，核仁明顯(圖1A)。F21 10 mg·L-1處理48 h后，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大量空泡，且密度降低，但細(xì)胞膜及細(xì)胞核保持完整(圖1B)。F21 30 mg·L-1處理后，細(xì)胞膜完整性破壞，胞漿內(nèi)有空泡形成，細(xì)胞核破碎，且密度降低(圖1C)。F21 100 mg·L-1處理后細(xì)胞破壞嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)消失(圖1D)。

Fig.1 Effect of F21 on HepG-2 cell morphology(Wright-Giemsa ×20).A:normal control group;B:F21 10 mg·L-1 group;C:F21 30 mg·L-1 group;D:F21 100 mg·L-1 group.Arrow shows typical morphological changes.

2.3 F21對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳

如圖2所見(jiàn)，正常對(duì)照組未見(jiàn)明顯的DNA降解片段，F(xiàn)21 10，30 和 100 mg·L-1處理 HepG-2 細(xì)胞48 h后，均未見(jiàn)特征性的DNA梯狀條帶。

Fig.2 Effect of F21 on HepG-2 cell apoptosis by agarose gel electrophoresis.Lane 1:DNA ladder marker;lane 2:normal control group;lane 3:F21 10 mg· L-1 group;lane 4:F21 30 mg·L-1 group;lane 5:F21 100 mg·L-1 group.

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)

圖3 結(jié)果顯示，F(xiàn)21 10，30 和100 mg·L-1處理細(xì)胞48 h后，HepG-2細(xì)胞晚期凋亡率分別為(17.34±0.01)%，(25.45 ±0.01)% 和(43.67 ±0.03)%，與正常對(duì)照組比較，均有顯著差異(P＜0.05)，且隨濃度增加，其凋亡率也增加(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of F21 on HepG-2 cell apoptosis by flow cytometry.A:normal control group;B:F21 10 mg·L-1 group;C:F21 30 mg·L-1 group;D:F21 100 mg·L-1 group.

2.4 Z-VAD-MFK對(duì)F21抑瘤活性的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，單獨(dú)F21 10和 30 mg·L-1及 STS 50 mol·L-1處理 12 h 后，細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.05)，F(xiàn)21+Z-VAD-FMK聯(lián)用組細(xì)胞存活率也明顯降低(P＜0.05);與單用F21細(xì)胞相比，F(xiàn)21+Z-VAD-FMK組細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異;與單用STS組相比，F(xiàn)21+Z-VAD-FMK組細(xì)胞存活率增加(P＜0.05)。此結(jié)果表明F21對(duì)HepG-2細(xì)胞殺傷不被胱天蛋白酶抑制劑阻斷，即其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制并非與胱天蛋白酶激活通路有關(guān)。

Tab.2 Effect of Z-VAD-FMK on proliferation of Hep G-2 cells

3 討論

自第一個(gè)植物來(lái)源的生物堿類抗腫瘤藥長(zhǎng)春堿1960年8月在美國(guó)上市以來(lái)，生物堿類抗腫瘤藥的發(fā)展十分迅速。特別是紫杉醇和喜樹堿的出現(xiàn)，成為抗腫瘤藥具有劃時(shí)代意義的藥物。研究表明生物堿抗腫瘤作用主要通過(guò):① 作用于細(xì)胞微管，抑制其解聚或聚合;②抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ活性;③ 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;④誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和抑制腫瘤細(xì)胞增殖;⑤ 作用于細(xì)胞膜等［5-6］。

本研究結(jié)果表明牛耳楓生物堿F21可明顯抑制HepG-2細(xì)胞的增殖，且有明顯的時(shí)效和量效關(guān)系，形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)21可使細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，隨著劑量的增加細(xì)胞膜完整性開始遭到破壞，最終致細(xì)胞核破碎，且伴隨著整個(gè)細(xì)胞的密度大幅降低，表明F21可通過(guò)引起細(xì)胞死亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

一般認(rèn)為細(xì)胞死亡的方式主要有細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡［7］，最新研究發(fā)現(xiàn)一種新的非凋亡性程序性死亡稱為 paraptosis［8］。Paraptosis在形態(tài)學(xué)上與凋亡不同，不具有凋亡的典型特征，即缺少染色質(zhì)的新月形凝集和凋亡小體。它是以胞漿空泡的形成為特征，在整個(gè)過(guò)程中胞漿和胞核密度增加，線粒體腫脹，但細(xì)胞膜和細(xì)胞器仍保持完整;無(wú)階梯狀DNA梯帶;paraptosis過(guò)程為胱天蛋白酶非依賴性的，而細(xì)胞凋亡典型的形態(tài)學(xué)變化為核固縮，有凋亡小體形成，DNA出現(xiàn)階梯帶變化，細(xì)胞凋亡過(guò)程為胱天蛋白酶依賴性［10-12］。本研究結(jié)果顯示小劑量的F21(10 mg·L-1)引起的細(xì)胞死亡從形態(tài)上看既不同于細(xì)胞壞死又不同于細(xì)胞凋亡，而類似于paraptosis。

本研究的瓊脂糖凝膠電泳中沒(méi)有出現(xiàn)典型的凋亡梯帶。3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量F21作用后出現(xiàn)了不同的DNA梯帶，關(guān)于造成此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示F21可誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞死亡，且隨濃度增加，其死亡率也增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果未出現(xiàn)明顯的早期凋亡，表明F21誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞死亡方式不同于典型的細(xì)胞凋亡。此外，凋亡抑制試驗(yàn)表明F21誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不被胱天蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK所抑制，即F21誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒(méi)有發(fā)生胱天蛋白酶的活化。

綜上所述，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察以及各種凋亡檢測(cè)方法的進(jìn)一步分析表明，F(xiàn)21可能通過(guò)類似于paraptosis的方式引起HepG-2細(xì)胞的死亡并發(fā)揮抗腫瘤作用，有可能發(fā)展成一種新的抗腫瘤藥物，其確切作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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