李延紅，周占業(yè)，史 齊，皇甫超申

(河南大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，2.第一附屬醫(yī)院，河南開(kāi)封 475004)

亞硝酸鹽廣泛存在于自然界水體、土壤、植物中，常用于食品保鮮劑和工業(yè)防腐劑，也被用于臨床治療氰化物中毒。亞硝酸鹽對(duì)人體健康的影響目前存在很大爭(zhēng)議［1］。過(guò)去普遍認(rèn)為亞硝酸鹽可以導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥并有致癌風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)在不斷有研究表明，低濃度亞硝酸鹽具有保護(hù)血管內(nèi)皮、降血壓和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等對(duì)人體有利的一面［2］。這就使得亞硝酸鹽這一古老的化合物有了新的研究?jī)r(jià)值。有實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)境化學(xué)毒物或物理?yè)p傷因子對(duì)組織細(xì)胞的作用效應(yīng)呈現(xiàn)出低濃度和高濃度作用相反的現(xiàn)象，該現(xiàn)象被稱為低促效應(yīng)(hormesis)［3］，化合物在低促效應(yīng)濃度范圍內(nèi)引起的促進(jìn)效應(yīng)超過(guò)對(duì)照組10%的濃度稱之為最低促進(jìn)濃度，用該濃度化合物預(yù)處理組織細(xì)胞，可以使其耐受該化合物高濃度的毒害作用［4］。為此，本文研究了低濃度亞硝酸鈉(NaNO2)預(yù)處理對(duì)高濃度NaNO2損傷PC細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤未分化型細(xì)胞株P(guān)C12購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。硝酸鈉(NaNO3)、NaNO2，無(wú)水乙醇，天津市晨?；瘜W(xué)試劑廠(分析純);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清，杭州四季青生物公司產(chǎn)品;羧基-2-(4-羧基)苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧-3-氧化物(carboxy-2-(4-carbo-xyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，c-PTIO)、二甲亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hoechst33258和碘化丙啶(propodium iodiole，PI)購(gòu)自Sigma公司。FITC-AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Bender)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及β肌動(dòng)蛋白抗體(碧云天公司)?？梢?jiàn)光法丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。BX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);FACS Salibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞生長(zhǎng)在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d換液1次為1代。

1.3 MTT分析細(xì)胞存活率

PC12細(xì)胞于5%CO237℃恒溫培養(yǎng)。至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶和EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107L－1接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［5］，本實(shí)驗(yàn)分別選用NaNO20.14，1.4 和 45 mmol·L－1濃度組，同時(shí)設(shè)同濃度的 NaNO3或 c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO3組。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入 20 μl MTT 5 g·L－1培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO于振蕩器上振搖，待藍(lán)色晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度(absorbance，A)。以含有等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無(wú)細(xì)胞孔測(cè)得的吸光度值為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(A處理組－A空白組)/(A對(duì)照組－A空白組)×100% 。

1.4 活細(xì)胞熒光染色判定細(xì)胞生存狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)分4組:正常對(duì)照組，只加等體積的培養(yǎng)液;NaNO245 mmol·L－1組，NaNO245 mmol·L－1處理細(xì)胞2 h;預(yù)處理組，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理24 h，然后再用 NaNO245 mmol·L－1處理 2 h;NO 清除組，c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO20.14 mmol·L－1共同預(yù)處理細(xì)胞24 h后再用NaNO245 mmol·L－1作用2 h。將不同處理的細(xì)胞培養(yǎng)在預(yù)置蓋玻片上，PBS洗3次，用特異結(jié)合DNA的熒光染料Hoechst 33258和PI聯(lián)染進(jìn)行活細(xì)胞聯(lián)染。加Hoechst33258 10 mg·L－1及 PI 10 mg·L－1，37℃染色 15 min 后，紫外激發(fā)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，CCD拍片?；罴?xì)胞呈淺藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈凝集的紅色或亮白色。熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每張爬片計(jì)數(shù)細(xì)胞不少于1000個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以凋亡細(xì)胞數(shù)與計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)百分比表示細(xì)胞凋亡率。

1.5 FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

按實(shí)驗(yàn)要求處理后，分別收集各組細(xì)胞到10 ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為1×109L－1，1000 ×g離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，1000×g離心5 min，用100μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，1000×g離心5 min，沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入AnnexinⅤ-FITC/PI溶液5 μl，4℃下孵育20 min，最后補(bǔ) PBS 400 μl，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。每個(gè)樣品檢測(cè)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，用Cellquest軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.6 細(xì)胞內(nèi)MDA含量和GSH-Px，SOD，CAT酶活性分析

實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA，GSH-Px含量和SOD，CAT酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行各種處理，作用24 h后用RIPA 200μl充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)樣品蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入各種一抗(1∶200)于4℃封閉袋中孵育過(guò)夜，二抗(1∶4000)孵育1 h。化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，并測(cè)定蛋白質(zhì)印跡條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)，以 與β肌動(dòng)蛋白的IA比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NaNO2對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

圖1 結(jié)果顯示，NaNO20.14 和 1.4 mmol·L－1組細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組分別增加15%和56%，NaNO245 mmol·L－1組細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組減少46%(P＜0.05)。同時(shí)加入c-PTIO后，細(xì)胞存活率較相應(yīng)濃度單獨(dú)NaNO2組明顯降低(P＜0.05)，但NaNO2對(duì)細(xì)胞存活率的低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象依然存在，未恢復(fù)至正常對(duì)照組水平(P＜0.05)。NaNO30.14 ～45 mmol·L－1對(duì)細(xì)胞存活無(wú)明顯影響。

Fig.1 Effect of sodium nitrite(NaNO2)on the survival rate of PC12 cells.PC12 cells were cultured with drugs for 24 h.Survival rate(%)=(A treatment － A blank)/(A control － A blank).ˉx ± s，n=3.*P ＜0.05，compared with normal control(0 mg·L －1)group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 group.

2.2 低濃度NaNO2預(yù)處理對(duì)高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，NaNO245 mmol·L－1處理組細(xì)胞存活率明顯下降(P ＜0.05)。與NaNO245 mmol·L－1組相比，預(yù)處理組細(xì)胞存活率明顯增加(P＜0.05)。與預(yù)處理組相比，預(yù)處理時(shí)同時(shí)加入c-PTIO 40μmol·L－1的NO清除組細(xì)胞存活率進(jìn)一步明顯下降(P＜0.05)。

Fig.2 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell survival exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by MTT.Cells were preconditioned with NaNO2 0.14 mmol· L－1 or NaNO2 0.14 mmol·L －1+c-PITO 40 μmol·L－1 for 24 h， then NaNO2 45 mmol·L －1 was added for anther 2 h cultivation.1:normal control group;2:NaNO2 group;3:NaNO2 0.14+NaNO2 45 group;4:c-PTIO+NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

2.3 低濃度NaNO2預(yù)處理對(duì)高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞凋亡的拮抗作用

FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖3)可見(jiàn)，正常對(duì)照組PC12細(xì)胞有少量細(xì)胞凋亡，NaNO245 mmol·L－1可誘導(dǎo)大批細(xì)胞凋亡，與正常對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。與NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率明顯減少(P＜0.05);與 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245 mmol·L－1組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高(P＜0.05)。

2.4 低濃度NaNO2預(yù)處理對(duì)NaNO2高度濃損傷PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Fig.3 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell apoptosis exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by FITC-annexinⅤ/PI double staining flow cytometry assay.See Fig.2 for the treatment.1:normal control group;2:NaNO2 group;3:NaNO2 0.14+NaNO2 45 group;4:c-PTIO+NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

Hoechst33258/PI活細(xì)胞雙染結(jié)果可見(jiàn)(圖4)，正常對(duì)照組細(xì)胞，生存狀態(tài)良好，有少量細(xì)胞凋亡;NaNO245 mmol·L－1處理導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡，凋亡率明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05);預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率與NaNO245 mmol·L－1組相比 ，明顯減少 (P＜0.05);與預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。

2.5 低濃度NaNO2預(yù)處理對(duì)高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞抗氧化能力的影響

如表1所示，與正常對(duì)照組相比，NaNO245 mmol·L－1處理組細(xì)胞內(nèi) CAT、SOD 和 GSH-Px活性明顯降低，MDA含量升高(P＜0.05);與NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力明顯升高，而MDA含量明顯下降(P ＜0.05)。與 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組相比，c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO20.14+NaNO245組抗氧化酶活性進(jìn)一步明顯降低，MDA含量明顯升高(P＜0.05)。

Fig.4 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell nucleus morphology exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by Hoechst33258/PI double staining.See Fig.3 for the legend.B was the statistical results of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

Tab.1 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on activities of catalase(CAT)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione peroxidase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)content in PC12 cells exposed to NaNO2 45 mmol·L －1

2.6 低濃度NaNO2預(yù)處理對(duì)高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞影響

圖5結(jié)果顯示，與對(duì)正常照組相比，NaNO245 mmol·L－1處理細(xì)胞可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞促凋亡蛋白Bax，胱天蛋白酶9，胱天蛋白酶3表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.05)。與NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞促凋亡蛋白 Bax，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達(dá)量下降，而凋亡抑制蛋白 Bcl-2表達(dá)量增加(P＜0.05)。與預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245組細(xì)胞促凋亡蛋白Bax，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達(dá)量有所增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量有所減少(P＜0.05)。

Fig.5 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L－1 preconditioning on the expression of apoptosis-related proteins in cells exposed to NaNO2 45 mmol·L－1 by Western blotting assay.See Fig.3 for the legend.Bwas the statistical results of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 mmol·L －1 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

2.7 低濃度NaNO2預(yù)處理對(duì)高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

圖6結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，NaNO245 mmol·L－1組細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)量有所增加(P ＜0.05);與 NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組 HIF-1α 表達(dá)量明顯增加(P ＜0.05);與 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245 組 HIF-1α 表達(dá)量進(jìn)一步明顯下降(P＜0.05)。

Fig.6 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on the expression of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in PC12 cells exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by Western blotting assay.See Fig.3 for the legend.Fig.B was the statistical results of Fig.A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜ 0.05，compared with NaNO2 45 mmol·L －1 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

3 討論

高濃度NaNO2可以造成細(xì)胞膜損害和DNA過(guò)氧化損傷，并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡［6］，低濃度NaNO2對(duì)組織細(xì)胞卻沒(méi)有明顯的毒害作用［7］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaNO20.14 和 1.4 mmol·L－1對(duì) PC12 細(xì)胞存活率有促進(jìn)作用，而 NaNO245 mmol·L－1明顯抑制細(xì)胞存活率;加入c-PTIO清除培養(yǎng)體系中的一氧化氮后，細(xì)胞存活率總體有所下降，但NaNO2對(duì)細(xì)胞存活率的低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象依然存在，而相同濃度的硝酸鈉對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響。結(jié)果提示，NaNO2可以引起PC12細(xì)胞存活率低濃度促進(jìn)效應(yīng)(低促效應(yīng))。這種現(xiàn)象很可能與一氧化氮-可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶-環(huán)一磷酸鳥(niǎo)苷通路激活有關(guān)［8］。在低促效應(yīng)濃度范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)選用最低促進(jìn)濃度，即 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理后，細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)、脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低、線粒體凋亡通路上促凋亡蛋白表達(dá)下降、凋亡抑制蛋白表達(dá)升高以及細(xì)胞凋亡減少。有研究認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于低濃度毒物預(yù)處理，細(xì)胞通過(guò)自穩(wěn)態(tài)調(diào)整，獲得了耐受更高濃度毒物的損害作用［9］。也有研究認(rèn)為低濃度NaNO2在體內(nèi)缺氧酸性環(huán)境下可以還原為一氧化氮，一氧化氮抑制線粒體呼吸鏈，減少活性氧產(chǎn)生，抑制細(xì)胞色素C釋放，從而減輕細(xì)胞過(guò)氧化損害和拮抗線粒體途徑凋亡［10］。本實(shí)驗(yàn)是在普通條件下培養(yǎng)的，培養(yǎng)液pH值由實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的7.3，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)降到6.3左右，在這種環(huán)境，培養(yǎng)體系中的亞硝酸鹽有可能部分還原為一氧化氮。用低濃度NaNO2預(yù)處理 PC12細(xì)胞，細(xì)胞獲得耐受高濃度NaNO2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象很可能與亞硝酸根離子和一氧化氮抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物，抑制細(xì)胞內(nèi)氧的消費(fèi)，減少活性氧產(chǎn)生，同時(shí)抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，減少線粒體途徑凋亡有關(guān)。這種現(xiàn)象在NaNO2預(yù)處理拮抗缺血再灌注時(shí)活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)［11］。

細(xì)胞內(nèi)HIF是一類進(jìn)化上高度保守的核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下累積，調(diào)控其下游紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和糖酵解等一系列與細(xì)胞低氧存活有關(guān)的基因，使細(xì)胞耐受缺氧或其他應(yīng)激環(huán)境［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度NaNO2預(yù)處理的細(xì)胞，HIF表達(dá)增加，這可能與低濃度亞硝酸鹽抑制細(xì)胞氧消費(fèi)有關(guān)。結(jié)果提示，低濃度NaNO2促進(jìn)細(xì)胞存活率增加，拮抗高濃度NaNO2對(duì)細(xì)胞過(guò)氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，與其促進(jìn)HIF在細(xì)胞內(nèi)累積增加有關(guān)。

低濃度NaNO2促進(jìn)PC12細(xì)胞存活率，高濃度抑制其存活率;低濃度NaNO2預(yù)處理PC12細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，增加HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)累積，拮抗高濃度NaNO2過(guò)氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體途徑凋亡，亞硝酸鹽還原的一氧化氮和亞硝酸根離子在其中協(xié)同發(fā)揮了重要作用。

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