霍仕霞，康雨彤，彭曉明，高 莉，唐曉琴，彭 英，閆 明

(1.新疆維吾爾醫(yī)藥研究所細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)室，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所分析室，新疆烏魯木齊 830004)

白癜風(fēng)的發(fā)生與酪氨酸酶活性、細(xì)胞黑素含量及黑素細(xì)胞增殖的關(guān)系非常密切。黑素細(xì)胞通過氧化酪氨酸合成表皮黑素，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶。文獻(xiàn)報(bào)道，增強(qiáng)酪氨酸酶活性和加速黑素生成的藥物能夠有效治療白癜風(fēng)［1］。維藥治療白癜風(fēng)有較好的療效，但作用機(jī)制尚不明確。驅(qū)白巴布期片是由補(bǔ)骨脂(Psoralea corylifolia L.)、驅(qū)蟲斑鳩菊〔Vernonia anthelmintica(Linn.)Willd〕、高良姜(Alpinia officinarum Hance)、盒果藤(Opercalina turperthum L.)和白花丹(Plumbago zeylanica L.)組成的維吾爾藥復(fù)方制劑，具有通脈和理血的作用，用于治療白癜風(fēng)［2］。本課題組通過工藝改進(jìn)，將其制備成驅(qū)白巴布期膠囊(qubaibabuqi capsule，QBC)。本研究從細(xì)胞水平探討該膠囊含藥血清體外對(duì)人黑素瘤細(xì)胞A375增殖和遷移、酪氨酸酶活性及黑素生成的影響，為臨床治療白癜風(fēng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SYXK(新)2003-0003。人黑素瘤細(xì)胞A375由上海中科院細(xì)胞庫提供。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

QBC由補(bǔ)骨脂、驅(qū)蟲斑鳩菊、高良姜、盒果藤和白花丹以質(zhì)量比6∶6∶3∶3∶2配伍組成，70%乙醇回流提取3次，濃縮干燥后，提取物加淀粉混勻，制備成每粒重0.25 g的膠囊(每粒膠囊相當(dāng)于原料藥0.1565 g)，其中每粒含補(bǔ)骨脂素不低于0.8041 mg，異補(bǔ)骨脂素不低于0.6606 mg，高良姜素不低于0.3522 mg。DMEM干粉培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司;胎牛血清，美國(guó)Hyclone公司;MTT，美國(guó)Amresco公司。YJ-875凈化工作臺(tái)，中國(guó)上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠;XD-101倒置顯微鏡，中國(guó)江南光電儀器有限公司;MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司;Bip-Rad550型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂公司;MM-3微量振蕩器，江蘇沈高康健生化器具廠;DK-80電熱恒溫水槽，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠。

1.3 QBC大鼠含藥血清的制備

QBC 200粒，去除膠囊殼，取內(nèi)容物，研勻。以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃用的藥液。將20只大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組和QBC 0.54，2.7 和5.4 g·kg－1組，禁食12 h 后，正常對(duì)照組大鼠ig給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，QBC組大鼠分別ig給藥。每天2次，連續(xù)3 d，末次給藥后2～3 h后腹主動(dòng)脈無菌取血，825×g分離血清，－20℃保存?zhèn)溆?。臨用前56℃滅活30 min，0.22μm微孔濾膜除菌［3－4］。

1.4 MTT法測(cè)定人黑素瘤A375細(xì)胞存活

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為5×107L－1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入最終濃度為5%，10%，20%和30%正常對(duì)照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h［5］。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加入 20 μl MTT 5 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min左右，使結(jié)晶完全溶解，立即于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度(absorbance，A)值［6］。每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.5 人黑素瘤A375細(xì)胞酪氨酸酶活性［7］的測(cè)定

分別將各組含藥血清加入細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，PBS液洗2次，每孔加體積分?jǐn)?shù)為0.01的 TritonX-100溶液50μl;迅速置 －80℃凍存30 min;隨后室溫融化;37℃預(yù)溫后加入0.1%左旋多巴溶液10μl，置37℃電熱恒溫水槽中反應(yīng)2 h，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A值。每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.6 人黑素瘤A375細(xì)胞黑素含量［8］的測(cè)定

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為5×107L－1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入終濃度為20%的正常對(duì)照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，用 PBS液洗 2次，每孔加入 100μl NaOH 1 mol·L－1，置 37℃ 48 h 后，于酶標(biāo)儀 490 nm 處測(cè)定A值。每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.7 人黑素瘤A375細(xì)胞遷移能力的測(cè)定

1.7.1 Transwell微孔膜法

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L－1，接種于24孔板，每孔1 ml。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基后，分別加入終濃度為20%的正常對(duì)照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰酶消化并用培養(yǎng)基稀釋為2×108L－1，取200μl加入用30μl人纖維粘連蛋白5 ml·L－1預(yù)處理過的Transwell小室的上室中繼續(xù)培養(yǎng)18 h，取出Transwell，用棉簽擦去上室細(xì)胞和人纖維粘連蛋白，用PBS洗3遍，將小室放入醋酸∶甲醇=1∶3(V/V)的固定液600μl中4℃固定30 min，晾干，姬姆薩染色10 min，PBS洗滌5遍，晾干后將小室放在載玻片上，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞，于不同視野拍照，每組8張，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)［9］。

1.7.2 劃痕實(shí)驗(yàn)

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為1×1011L－1，接種于24孔板，每孔1 ml。培養(yǎng)24 h后，用200μl槍頭在孔底均勻劃出2道劃痕，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕清洗3次，除去漂浮細(xì)胞。分別加入終濃度為20%的正常對(duì)照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液1 ml。每組2個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況［10］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 含QBC血清對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，QBC 0.54 g·kg－1組大鼠含藥血清濃度為 30% 時(shí)，對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞具有促增殖作用(P＜0.05);QBC 2.7 g·kg－1大鼠含藥血清濃度為10%時(shí)具有促增殖作用(P ＜0.01);QBC 5.4 g·kg－1含藥血清濃度為20%時(shí)具有促增殖作用(P＜0.05)。

2.2 含QBC血清對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，QBC 0.54 g·kg－1組含藥血清濃度為 5%時(shí)對(duì) A375 人黑素瘤細(xì)胞具有促酪氨酸酶活性的作用(P＜0.05);QBC 2.7 g·kg－1組含藥血清濃度為5%和 10%時(shí)，有抑制酪氨酸酶活性作用(P＜0.01或P＜0.05);QBC 5.4 g·kg－1組含藥血清濃度為 5%，10% 和 20%時(shí)，有促酪氨酸酶活性作用(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 含QBC血清對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞黑素生成的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，QBC 2.7和5.4 g·kg－1含藥血清對(duì) A375細(xì)胞具有顯著促黑素含量增加的作用(P ＜0.05，P ＜0.01);且 QBC 5.4 g·kg－1含藥血清促黑素含量增加的能力明顯高于 QBC 2.7 g·kg－1(P ＜0.01)。QBC 0.54 g·kg－1含藥血清無顯著增加黑素含量的作用。

Tab.1 Effect of Qubaibabuqi capsule(QBC)containing serum on human melanoma A375 cell proliferation

Tab.2 Effect of serum-containing QBC on tyrosinase activity of human melanoma A375 cells

Tab.3 Effect of QBC containing 20%serum on melanin content in human melanoma A375 cells

2.4 QBC含藥血清對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell微孔膜法實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，與正常對(duì)照組相比，QBC 0.54，2.7 和 5.4 g·kg－1大鼠20%含藥血清均能顯著提高A375細(xì)胞的遷移能力(P ＜0.01)。QBC 5.4 g·kg－1含藥血清促 A375 細(xì)胞的遷移能力明顯高于2.7 g·kg－1，并且有隨劑量增加作用增強(qiáng)的趨勢(shì)。

劃痕結(jié)果表明(圖1)，與正常對(duì)照組的(104±6)μm相比，QBC 0.54，2.7 和 5.4 g·kg－1含藥血清組細(xì)胞劃痕邊界距離分別為50±3，43±5和(12±2)μm，說明均能明顯促進(jìn)A375細(xì)胞傷痕愈合，而QBC 5.4 g·kg－1含藥血清促傷口愈合能力明顯強(qiáng)于 QBC 0.54和2.7 g·kg－1組(P ＜0.01)，提示 QBC 可能有促進(jìn)A375細(xì)胞遷移的能力。

Tab.4 Effect of QBC containing 20%serum on migration of human melanoma A375 cells

Fig.1 Effect of QBC on migration of A375 cells.A:normal control;B，C and D:QBC 0.54，2.7 and 5.4 g·kg－1 group，respectively.

3 討論

血清藥理學(xué)是近年來建立和發(fā)展起來的一種適合于體外研究中藥藥理的新方法，主要是通過研究給藥動(dòng)物血清的生物學(xué)活性來揭示藥物作用機(jī)制。本研究通過合并一組動(dòng)物的血清消除個(gè)體差異。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行了含藥血清滅活與不滅活的比較及采用不同給藥劑量進(jìn)行體外篩選，最后確定采用滅活后的含藥血清，增大給藥劑量以便優(yōu)選體外實(shí)驗(yàn)所需合適的血清比例，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性［11］。

近年來，針對(duì)中藥對(duì)酪氨酸酶活性影響進(jìn)行了較大規(guī)模篩查，并在此基礎(chǔ)上以黑素瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，QBC含藥血清顯著促進(jìn)黑素的合成，且具有一定的劑量相關(guān)性，并能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)早期皮損處黑素細(xì)胞數(shù)量明顯減少，故細(xì)胞數(shù)量的增加在一定程度上有利于色斑恢復(fù)［12］。QBC含藥血清能夠上調(diào)酪氨酸酶活性，促使黑素細(xì)胞合成色素增加。

白癜風(fēng)晚期患者皮膚基底層黑素細(xì)胞完全消失，患者白斑區(qū)色素恢復(fù)只能依賴于毛囊外毛根鞘處黑素細(xì)胞儲(chǔ)庫或白斑區(qū)周邊黑素細(xì)胞的活化、增殖和遷移，且以毛囊為主。刺激毛囊前體及白斑區(qū)周邊區(qū)黑素細(xì)胞增殖和向病灶遷移亦是一條重要的治療思路。本研究在觀察了QBC對(duì)黑素合成影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響，有助于全面闡明其作用機(jī)制。

本研究表明，QBC不但能促進(jìn)黑素合成，還能促使黑素細(xì)胞向病灶部位遷移，提示其可能通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮治療作用，但對(duì)其中的具體有效活性成分尚待更深入的研究。

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