人膝骨關(guān)節(jié)炎血清生物學(xué)標(biāo)志物的篩選*

曾 花， 蔡道章， 陳郁鮮， 曾 春， 葉志強(qiáng)， 莊 澤， 黎明濤， 胡坤華

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1急診科，2骨科，廣東廣州510630;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心，廣東廣州510080)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是由于機(jī)械和生物性因素共同作用所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨合成和降解動態(tài)失衡所致的全關(guān)節(jié)疾病［1］。OA以中老年患者多見，且女性多于男性，60歲以上人群患病率可達(dá)50%，75歲以上人群則達(dá)80%，該病的致殘率可高達(dá)53%，好發(fā)于負(fù)重大、活動多的關(guān)節(jié)，如膝、脊柱、髖、踝、手等關(guān)節(jié)［2］。發(fā)展到中晚期的OA往往需要手術(shù)來減輕疼痛、矯正畸形和改善關(guān)節(jié)功能，但手術(shù)不僅給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也不能很好地解決關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和重建問題。然而OA的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)志物及早期診斷和治療的方法，因此采取新的方法和手段闡明OA的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的疾病診斷標(biāo)志物對提高OA患者的生活質(zhì)量有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時代的一門新興科學(xué)，是對生物體在蛋白質(zhì)水平上定量、動態(tài)、整體性的研究，同時也能為闡明眾多疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論根據(jù)和解決途徑。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D－DIGE)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離－飛行時間質(zhì)譜(matrix－assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)，成功建立了OA血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，通過對篩選出的差異蛋白的進(jìn)一步研究，為發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記物和藥物治療靶點(diǎn)，以及發(fā)病機(jī)制的研究提供重要線索。

材料和方法

1 材料和儀器

1．1 主要試劑 十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、過硫酸銨、丙烯酰胺、N，N'－亞甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸等均購自Sigma;去血清高峰度蛋白試劑盒ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit購自Merck;蛋白質(zhì)純化試劑盒Clean－up Kit、蛋白定量試劑盒2D Quant Kit、熒光標(biāo)記試劑盒CyDye DIGE Fluor Labeling Kit、固相pH值干膠條、IPG buffer等均購自 GE，α2－巨球蛋白(α2－macroglobulin，α2M;ab36995)Ⅰ抗購自Abcam，Ⅱ抗購自Jackson。

1．2 主要儀器和設(shè)備 IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)、Typhoon 9400型多功能激光掃描儀、DIGE分析軟件DeCyder 6．0和全自動斑點(diǎn)工作站Ettan Spot Handing Workstation均為GE產(chǎn)品，質(zhì)譜儀Ultraflex III為布魯克產(chǎn)品;電泳凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon－2500為上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2．1 實(shí)驗對象 從中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科住院治療的30例診斷明確膝骨關(guān)節(jié)炎患者中隨機(jī)抽取4例組成本研究的OA實(shí)驗組，并根據(jù)實(shí)驗組挑選年齡、性別和體重指數(shù)(body mass index，BMI)分別對應(yīng)匹配的4例健康志愿者組成本研究的對照組。本實(shí)驗標(biāo)本的獲取均已征得入組人員的同意，符合相關(guān)衛(wèi)生部門的倫理委員會原則。

實(shí)驗組需滿足的條件:(1)診斷明確的骨關(guān)節(jié)炎患者:臨床診斷參照2007年《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》［2］;(2)無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等結(jié)締組織病;(3)無肝腎功能不良，免疫系統(tǒng)疾病;(4)抽血前1周內(nèi)未曾使用過非甾體類鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)激素等;(5)無藥物過敏史;(6)非孕婦、哺乳期、月經(jīng)期婦女;(7)既往無關(guān)節(jié)感染、結(jié)核、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷手術(shù)史。對照組需滿足的條件:無包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)疾病的現(xiàn)病史和既往史。

2．2 樣品實(shí)驗前處理 所有血清樣本取清晨空腹靜脈血3 mL，室溫下靜置1 h，4℃、2 500×g離心15 min取上清，用0．2 mL EP管分裝，－80℃保存?zhèn)溆?。集齊血清樣本后，用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit試劑盒去除高豐度蛋白，然后對樣本進(jìn)行純化和定量，隨后按熒光標(biāo)記試劑盒說明書對蛋白樣品進(jìn)行CyDye熒光標(biāo)記。2D－DIGE的實(shí)驗設(shè)計為:從正常對照組N1～N4和OA實(shí)驗組A1～A4 8個血清樣本中各取25μg蛋白共200μg進(jìn)行Cy2熒光標(biāo)記，作為內(nèi)參照(消除膠與膠之間的差異);取N1、N2、A3、A4 4個血清樣本各50μg蛋白進(jìn)行 Cy3熒光標(biāo)記;取 A1、A2、N3、N4 4個血清樣本各50 μg蛋白進(jìn)行Cy5熒光標(biāo)記(交叉標(biāo)記以消除不同熒光染色效率不同的誤差)。50μg Cy2標(biāo)記的內(nèi)參照、Cy3標(biāo)記的N1和Cy5標(biāo)記的A1混合后進(jìn)行雙向電泳分離，命名為膠1;同理，內(nèi)參照、N2和A2混合后為膠2，內(nèi)參照、A3和N3混合后為膠3，內(nèi)參照、A4和N4混合后為膠4。

2．3 2D－DIGE雙向電泳 選擇pH 4～7、24 cm的IPG膠條對血清樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行第一向等電聚焦(isoelectric focusing，IEF);IEF 參數(shù)設(shè)置為:30 V、6 h;60 V、6 h;200 V、1 h;500 V、2 h;1 000 V、2 h;3 500 V、2．5 h;10 000 V、1 h;10 000 V、8 h;500 V、12 h;78 350 VHr收膠。IEF完成后，在平衡緩沖液中平衡膠條，將其轉(zhuǎn)移至12．5%SDS－PAGE膠上進(jìn)行第二向電泳，電泳參數(shù)設(shè)置為:第一步蛋白轉(zhuǎn)移:2 W/gel，電泳時間 50 min;第二步垂直電泳:17 W/gel，電泳直至溴酚藍(lán)跑出凝膠下緣10 min(注:2D－DIGE凝膠的電泳在避光條件下進(jìn)行)。

2．4 圖像采集與分析 用Typhoon 9400型多功能激光掃描儀凝膠蛋白圖像，使用ImageQuant軟件收集凝膠蛋白圖像，使用DeCyder 6．0軟件對凝膠蛋白圖譜進(jìn)行分析，選取蛋白豐度差異＞1．2倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)、t檢驗 P＜0．05的斑點(diǎn)作進(jìn)一步分析。

2．5 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜圖的獲取及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析

在Spot Handling Workstation中切取差異蛋白點(diǎn)，將切取的蛋白點(diǎn)進(jìn)一步酶解，使用Bruker的Ultraflex III質(zhì)譜儀對酶解樣品進(jìn)行MALDI－TOF－MS分析，獲得樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass figerprinting，PMF)。所獲得圖譜使用Biotools軟件檢索，以Mascot(http://www．matrixscience．com)為搜索引擎在數(shù)據(jù)庫 Swiss－ Prot/Uniprot(http://www．expasy．ch/sprot/)中檢索，檢索種屬為human。

2．6 Western blotting分析 取30μg血清樣品蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE電泳)后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉該膜37℃ 1 h，沖洗后加入Ⅰ抗稀釋液(稀釋度1∶2 000)4℃孵育過夜后，再加入相應(yīng)的Ⅱ抗稀釋液37℃ 孵育1 h。經(jīng)ECL顯影后，用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)分析灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，采用軟件SPSS13．0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2D－DIGE圖像采集及蛋白表達(dá)

依照2D－DIGE實(shí)驗設(shè)計，依次進(jìn)行實(shí)驗樣品的CyDye熒光染色、第一向IEF電泳、第二向的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)和2D－DIGE凝膠的掃描，得到分別由Cy2、Cy3和Cy5標(biāo)記的不同血清蛋白樣品的蛋白斑點(diǎn)圖和不同熒光疊置所得的膠內(nèi)差異圖像，按實(shí)驗設(shè)計進(jìn)行電泳所得的4張2DDIGE凝膠的熒光疊置圖像，各膠檢測到的蛋白斑點(diǎn)數(shù)分別為1567、1587、1583和1675，實(shí)驗各膠的匹配率達(dá)71%。經(jīng)DeCyder軟件分析兩組間蛋白豐度差異大于1．2倍，且具有統(tǒng)計學(xué)意義的點(diǎn)共有14個，其中有9個蛋白點(diǎn)在OA實(shí)驗組表達(dá)上調(diào)，它們在膠上的編號為:318、536、546、757、769、773、912、916 和9175;5個蛋白點(diǎn)在OA實(shí)驗組表達(dá)下調(diào)，它們在膠上的編號為:657、974、1196和1221。差異蛋白點(diǎn)在2D－DIGE凝膠上的具體位置，見圖1。

Figure 1．The full view of protein spots．The marked spots were identified．圖1 差異蛋白點(diǎn)在2D－DIGE凝膠的具體位置

2 質(zhì)譜鑒定聯(lián)合數(shù)據(jù)庫匹配分析結(jié)果

進(jìn)行MALDI－TOF－MS鑒定的14個斑點(diǎn)均獲得了較好的圖譜，這些圖譜以Mascot(http://www．matrixscience．com)為搜索引擎，聯(lián)合檢索數(shù)據(jù)庫Swiss－ Prot/Uniprot(http://www．expasy．ch/sprot/)初步鑒定出OA實(shí)驗組與對照組間蛋白豐度差異大于1．2倍且有統(tǒng)計學(xué)意義的點(diǎn)共8個，其中有5個蛋白在OA組表達(dá)上調(diào)，3個蛋白在OA組表達(dá)下調(diào)，見表1。雙向電泳能根據(jù)分子量和等電點(diǎn)對蛋白質(zhì)進(jìn)行二維分離，蛋白質(zhì)經(jīng)過磷酸化、乙?；⑻腔刃揎椇蟮入婞c(diǎn)和分子量與原始狀態(tài)相比會出現(xiàn)偏差，在雙向電泳圖譜上表現(xiàn)為在不同位置出現(xiàn)的蛋白斑點(diǎn)。例如本研究中α2－macroglobulin分別在5個位置出現(xiàn)，inter－alpha－trypsin inhibitor heavy chain 4和kininogen－1分別在2個位置出現(xiàn)，但經(jīng)質(zhì)譜鑒定均為同一種蛋白。

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜鑒定Table 1．Results of MALDI－TOF－MSanalysis

3 Western blotting實(shí)驗結(jié)果

我們進(jìn)一步采用臨床樣本進(jìn)行了Western blotting驗證，結(jié)果表明，OA患者血清中α2M明顯高于正常對照，見圖2。

Figure 2．Expression ofα2 M in the sera of OA patients and the controls detected by Western blotting．N:control group;A:OA group．ˉx±s．n=15．*P＜0．05 vs control．圖2 Western blotting檢測α2 M的表達(dá)

討 論

隨著全球向老齡化社會的發(fā)展，OA已成為中老年人慢性殘障最常見的原因之一。有研究結(jié)果統(tǒng)計顯示，在所有導(dǎo)致老年殘障的疾病中，單純的膝骨關(guān)節(jié)炎的致殘率僅次于心血管疾病，處于第2位［3］，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。但對于骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防、早期診斷及治療目前仍缺乏高效的方法。因此，對于骨關(guān)節(jié)炎，尤其是對膝骨關(guān)節(jié)炎等大骨關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎的預(yù)防、早期診斷、早期治療及發(fā)病機(jī)制的深入研究具有重大意義，關(guān)于這方面的研究也越來越受到我國乃至全球醫(yī)療機(jī)構(gòu)和科研機(jī)構(gòu)的重視。目前，關(guān)于OA的研究大多數(shù)以涉及OA病理改變的軟骨、滑膜為中心而展開的，實(shí)驗主要針對這些組織中的一種或幾種因素與OA的關(guān)系，而且是基于某種假定成立的預(yù)期理論進(jìn)行的，這些研究的目的也是為了證實(shí)或者否定這些假定的理論。然而，蛋白質(zhì)組學(xué)這一高通量、高敏感性和高精確度研究方法的出現(xiàn)，打破了傳統(tǒng)研究手段的限制，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可同時檢測不同樣品不同狀態(tài)下成千上萬的蛋白，這一技術(shù)的出現(xiàn)有利于新的蛋白生物學(xué)標(biāo)志物、新藥物治療靶點(diǎn)及新作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)。目前，我國已有不少研究將蛋白組學(xué)的相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于各種疾病診斷及治療的研究中，如梁瓊等［4］等利用蛋白組學(xué)技術(shù)尋找骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的分子標(biāo)記物;張曉雪等［5］利用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清特異性標(biāo)志物;而胡志成等［6］則利用蛋白組學(xué)技術(shù)尋找病理性瘢痕形成機(jī)制中的特異蛋白為病理性瘢痕形成機(jī)制提供了新的思路。同時國內(nèi)外也有不少研究將蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于OA的相關(guān)研究中，但大多數(shù)研究不約而同地選擇了涉及OA病理改變的軟骨、滑膜、關(guān)節(jié)液作為研究對象，多數(shù)理論也認(rèn)為OA是關(guān)節(jié)軟骨的局部病變。但是，目前仍沒有任何一種關(guān)于OA的發(fā)病機(jī)制的假設(shè)理論經(jīng)研究證實(shí)是一定成立的。因此，本研究突破以往研究思路的限制，選擇血清蛋白作為研究對象，期望能通過對OA血清蛋白質(zhì)組學(xué)的比較分析，為OA發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路和實(shí)驗基礎(chǔ)，尋找新的OA疾病相關(guān)蛋白，篩選出能用于OA診斷、治療或發(fā)病機(jī)制研究的血清生物學(xué)標(biāo)記物。

本研究采用2D－DIGE聯(lián)合MALDI－TOF－MS的比較蛋白組學(xué)研究方法，成功建立了OA患者血清雙向熒光膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)體系，獲得了分離效果良好、清晰的蛋白斑點(diǎn)圖譜，每張膠均檢測到數(shù)以千計的蛋白點(diǎn)，且膠與膠之間的蛋白斑點(diǎn)匹配率較高，通過DeCyder軟件找到了OA患者血清中8個具有顯著差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，成功建立了OA血清差異蛋白組學(xué)的研究方法，為尋找OA血清生物標(biāo)記物和OA疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的研究提供了實(shí)驗基礎(chǔ)。

經(jīng)生物信息學(xué)檢索顯示，本研究所鑒定的在OA患者血清中差異表達(dá)的8個蛋白均直接或間接地參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自身免疫反應(yīng)，提示骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及自身免疫反應(yīng)有著密切的關(guān)系。而通過對其它應(yīng)用蛋白組學(xué)進(jìn)行的OA相關(guān)研究的文獻(xiàn)與本研究比較發(fā)現(xiàn)，α2M極有可能為OA的早期診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)記物，為OA的早期治療提供新的藥物治療靶點(diǎn)，同時也為OA發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的線索，然而其具體應(yīng)用價值尚需大量的后續(xù)實(shí)驗研究工作。

α2M是由肝臟內(nèi)皮細(xì)胞分泌的廣譜蛋白酶抑制劑，主要存在于血漿中，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)過程［7－8］，為 IL －1/IL －8/TNF 等炎癥因子提供結(jié)合位點(diǎn)，有研究表明其與阿爾茨海默病的發(fā)病有關(guān)［9－10］。

雖然骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生主要是由軟骨細(xì)胞外基質(zhì)膠原和聚集蛋白聚糖的丟失引起的［11］。軟骨聚集蛋白是由ADAMTS－4/5、ADAMTS－7/12等聚集蛋白聚糖酶降解，ADAMTS－4/5的抑制劑對軟骨蛋白聚糖的分解和代謝起調(diào)節(jié)作用，任何情況的抑制阻斷將會加速軟骨聚集蛋白聚糖的降解，之前TIMP－3是唯一一個被發(fā)現(xiàn)的ADAMTS－4/5內(nèi)源性抑制劑，目前研究發(fā)現(xiàn)α2M是另一個抑制劑［12］。另有研究證明，α2M是一個新發(fā)現(xiàn)ADAMTS－7/12的底物，兩者結(jié)合可抑制ADAMTS－7/12對COMP的降解，同時α2M也是一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)清除劑，參與 OA的病理過程［13］。張洪等［14］通過比較兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨與正常兔膝軟骨，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中α2M的表達(dá)在兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型組陽性率均高于對照組，同時實(shí)驗組軟骨細(xì)胞凋亡的程度與α2M的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明α2M與骨關(guān)節(jié)發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。林子洪等［15］通過對創(chuàng)傷性兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型采用α2M關(guān)節(jié)內(nèi)注射與陰性對照比較，發(fā)現(xiàn)α2M治療組的半月板退變速度稍慢，半月板纖維和細(xì)胞情況較好，其對關(guān)節(jié)炎癥有直接的抑制作用，但對滑膜炎癥的抑制作用較弱，提示α2M可能適合OA發(fā)病初期的保護(hù)性治療和研究。而李蔚勃等［16］通過文獻(xiàn)研究分析總結(jié)α2M對骨關(guān)節(jié)炎的影響可能是通過抑制MMP參與自由基的清除，通過轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)MMP1的合成與代謝參與免疫過程，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗OA組血清α2M的升高，可能是由于OA機(jī)體自身對抗疾病的一個保護(hù)性機(jī)制導(dǎo)致其分泌增多，而其是否與關(guān)節(jié)軟骨局部的表達(dá)水平一致，以及與OA發(fā)病機(jī)制的具體關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

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