罕見開米拉A3B3血型的分子生物學(xué)研究

陳愛蓉，黃 毅

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

開米拉(Chimeras)是指一個(gè)個(gè)體中同時(shí)存在兩個(gè)或以上不同來源的細(xì)胞的現(xiàn)象[1]。開米拉可以分為先天性的(如雙生子之間通過血管交叉吻合而產(chǎn)生的)和獲得性的(如異體造血細(xì)胞輸注或移植)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的開米拉現(xiàn)象主要有兩種：一種是血型開米拉，也稱做Twin Chimeras，是由于雙生子之間的血管存在交叉吻合，造血細(xì)胞通過吻合的血管交換而產(chǎn)生的。另一種開米拉為全身性的開米拉，又稱為 Tetragmetic Chimeras[2，3]，是指同一個(gè)體的不同組織中存在著不同來源的細(xì)胞的現(xiàn)象。這兩種開米拉現(xiàn)象可以單獨(dú)或同時(shí)存在。

人類血型開米拉十分罕見，常常是在ABO血型鑒定中檢測到同時(shí)存在兩種紅細(xì)胞而被發(fā)現(xiàn)的。開米拉現(xiàn)象常常會導(dǎo)致ABO血型遺傳學(xué)的不相符。本文以一例12歲的男孩和他的父母、祖父3代4人的家系為研究對象，對罕見的血型開米拉進(jìn)行分子遺傳學(xué)的研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 檢測對象是一個(gè)12歲的男孩，因發(fā)現(xiàn)右下腹包塊伴腹痛2d入我院，嵌頓疝術(shù)前常規(guī)血型鑒定中發(fā)現(xiàn)血型鑒定困難。我們分別采集了該男孩和他父母、祖父共計(jì)4人的血液標(biāo)本7ml：5ml不抗凝血，用于ABO血型分型；2ml EDTA抗凝血，用于DNA檢測。該家系籍貫為湖南韶山，均沒有輸血史及血液病史，患者為獨(dú)生子女。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ABO血型血清學(xué)鑒定 血型正反定型、吸收放散試驗(yàn)、唾液型物質(zhì)測定均按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的試管法，其中2套單克隆抗A、抗B血清(長春博德，長春生物制品有限公司；Dominion Inc，加拿大)，抗AB(Bioscot，英國)、抗 A1 植物凝集素(Immucor公司)、抗H血清(Dominion公司)，反定型紅細(xì)胞(上海血液技術(shù)公司)。

1.2.2 ABO基因PCR-SSP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物)分型 快速鹽析法從樣本外周血中抽提基因組DNA，DNA樣品于-20°C冷凍保存。使用G&T公司ABO基因分型試劑盒進(jìn)行等位基因分型[4，5]，該試劑盒含有4對序列特異性引物，通過PCR-SSP分別檢測ABO基因核苷酸序列的A1，A201，O1和B4個(gè)等位基因。內(nèi)對照為擴(kuò)增人類生長激素(HGH)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為207bp。采用熱啟動技術(shù)即 95℃預(yù)溫 5min，然后 95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5min進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物檢測：4.0%瓊脂糖，10v/cm電泳25min。紫外燈下確定結(jié)果。

1.2.3 家系的ABO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測序使用自行設(shè)計(jì)的引物AF1，AR1，進(jìn)行包含ABO基因第6外顯子、第6內(nèi)含子、第7外顯子約2200bp片斷的PCR擴(kuò)增，每種PCR反應(yīng)體系包括dNTP 1mM，MgCl21mM，2×GC buffer Ⅱ2μM，LATaq 酶2U(Takara大連寶生物公司)，模板DNA 200ng/ul，每條引物1μM；終體積50μl。反應(yīng)在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行，95℃ 10min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃150s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。膠回收，使用TA Cloning Kit試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行克隆，使用2.1載體轉(zhuǎn)染進(jìn)感受態(tài)TOP10細(xì)胞，挑取隨機(jī)菌株，抽提所需質(zhì)粒DNA(小量質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖?上海華舜公司)，使用表中所列的測序引物 AF2、AF3、AF4、AF5、AF6， 在 ABI 3100 測序儀上檢測，SeqPOP6BDv 1軟件分析結(jié)果。這5個(gè)引物都是正向引物，前一引物3’端和后一引物5’端會產(chǎn)生重疊。這樣得到包括完整的Exon6和Exon7的基因序列。

1.2.4 HLA-A、B、DRB1 3個(gè)位點(diǎn)的 PCR-SSP分型使用HLA分型試劑盒 (Dynal Biotech LLC，WI53223)，按照廠家提供操作規(guī)程，PCR-SSP法對HLAⅠ類(A，B)，Ⅱ類(DRB1)等位基因分型，瓊脂糖電泳產(chǎn)物，紫外燈下確定結(jié)果。

1.2.5 STR-PCR擴(kuò)增 用雙盲法復(fù)合短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)位點(diǎn)熒光標(biāo)記擴(kuò)增法檢測 15個(gè)常染色體位點(diǎn)(D5S818、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11、D18S51、D3S1358、VWA、FGA、TH01、D16D539、D2S1338、D19D433、TPOX、CSF1P0)和1個(gè)性染色體Amelogenin位點(diǎn)來鑒定3代親緣關(guān)系。使用ABI AmpFlSTR PCR擴(kuò)增試劑盒 (Biotest)，對4個(gè)家庭成員的DNA擴(kuò)增，ABI Prism3100 DNA測序儀以及ABI Genotyper 3.7軟件對擴(kuò)增產(chǎn)物及STR等位基因進(jìn)行分析。 根據(jù)公式(I=X/Y)，將每個(gè)STR結(jié)果與中國南方漢族人群的STR等位基因頻率比對，計(jì)算出PI值。

表1 用于克隆擴(kuò)增及序列測定的引物

2 結(jié)果

2.1 ABO血型鑒定

患者血型鑒定實(shí)驗(yàn)中，正定實(shí)驗(yàn)顯示與抗A、抗B抗體反應(yīng)，肉眼觀察凝集顆粒較小，鏡檢下呈現(xiàn)混合外觀：有凝集的細(xì)胞團(tuán)，有游離的紅細(xì)胞；反定實(shí)驗(yàn)顯示該男孩血清中沒有A抗體，B抗體；吸收放散試驗(yàn)、唾液型物質(zhì)試驗(yàn)均顯示含A、B抗原，血清學(xué)鑒定該男孩為A3B3型，祖父、父親、母親的血型分別為正常的A型、O型和AB型。血型結(jié)果如圖1。

圖1 罕見開米拉血型家系圖譜

2.2 ABO基因分型及克隆測序結(jié)果

如圖1所示，AB O基因分型祖父為A1O1，父親為O1O1，母親為A1B，而患者的電泳中出現(xiàn)了A1、B1、O13 個(gè)等位基因條帶，其中 B1、O1條帶清晰，A1條帶模糊。為排除PCR-SSP法假陽性，進(jìn)一步運(yùn)用克隆測序技術(shù)，對患者混合培養(yǎng)的PCR產(chǎn)物隨機(jī)挑取得到的21個(gè)重組克隆進(jìn)行分析，與標(biāo)準(zhǔn)序列(A101等位基因，Genbank：AF134412)相比較，這些克隆產(chǎn)物包括1個(gè)A102等位基因克隆，6個(gè)B101等位基因克隆，以及15個(gè)O01等位基因克隆 (如圖2)。 綜上，顯示該男孩為 A102、O01，B101嵌合的三倍體開米拉。

圖2 A102、B101、O01 3個(gè)等位基因克隆測序圖譜

2.3 PCR-SSP法HLA分型結(jié)果

HLA-A、B以及HLA-DRB1分型結(jié)果為如下(表2)：表中紅色字為額外的單倍體。本文中電泳條帶不是太清晰故判斷為額外單倍體，可能是此等位基因在體內(nèi)少量存在。

表2 HLA-A、B以及HLA-DRB1分型結(jié)果

2.4 STR-PCR擴(kuò)增

常染色體STR位點(diǎn)檢測結(jié)果顯示該男孩的D8S1179和vWA位點(diǎn)為三倍體。D8S1179額外的單倍體可能來自于父母雙方，vWA位點(diǎn)額外的單倍體來自父親一方(如圖3)。

圖3 STR位點(diǎn)中D8S1179和vWA位點(diǎn)圖譜

3 討論

在這一家系中，該男孩在外科手術(shù)前常規(guī)血型鑒定出現(xiàn)困難，后經(jīng)詳細(xì)的血清學(xué)方法鑒定為A3B3型后，父母分別為O型和AB型，又出現(xiàn)與其父母的血型不符合常規(guī)的遺傳規(guī)律。而STR實(shí)驗(yàn)可確定患者與父母的親權(quán)關(guān)系。深入探討該家系的ABO遺傳基礎(chǔ)顯得非常迫切。

原則上ABO血型遺傳符合孟德爾經(jīng)典的遺傳規(guī)律，到目前為止，只報(bào)道過幾例ABO表型和孟德爾遺傳規(guī)律相違背的現(xiàn)象。對這一現(xiàn)象，目前有4種可能的解釋：1、Cis-AB型和B(A)型。Cis-AB型和B(A)型可能與A、B抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶異常有關(guān)。在這兩種情況下，糖基轉(zhuǎn)移酶具有雙重功能活性[6,7]，既可以催化A抗原合成，又能催化B抗原的形成。2、ABO基因亞型的存在。這些亞型的表達(dá)程度主要與該等位基因表達(dá)增強(qiáng)或者連鎖式遺傳有關(guān)，或者可以說ABO基因在表達(dá)過程中會相互影響[8，9]。3、ABO基因的重組和轉(zhuǎn)換，可以引起其表現(xiàn)型的多樣性。在減數(shù)分裂時(shí)期，B和O等位基因會融合雜交，這一基因的雜交重組多發(fā)生于第6內(nèi)含子中，重組后的雜交基因表現(xiàn)為A基因活性。這是因?yàn)榈?外顯子之前的核苷酸為B基因來源，而第7外顯子為O基因來源，且O基因與第6外顯子nt-261位G缺失的A等位基因很相似，故表現(xiàn)為A型。中國和日本已有相關(guān)的家系調(diào)查的報(bào)道[10，11]。R102/O雜交型基因個(gè)體，由于R102/O雜交基因有nt-261位G的缺失，而表現(xiàn)為O型，但是R102/B雜交基因的個(gè)體則表現(xiàn)為B(A)型。4、體內(nèi)同時(shí)存在兩種細(xì)胞系的開米拉或馬賽克，表達(dá)成不同的血型。

本次研究中的這個(gè)男孩可確定為一例罕見的血型開米拉：21個(gè)混合培養(yǎng)的細(xì)胞克隆產(chǎn)物中，除了B101等位基因與O01等位基因，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)A102單倍體，這可證明該男孩為開米拉血型。HLA-B、DRB1位點(diǎn)也發(fā)現(xiàn)額外單體，STR-PCR的結(jié)果顯示，其15個(gè)常染色體位點(diǎn)中有2個(gè)位點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)有2個(gè)以上等位基因，這一結(jié)果也證實(shí)了該男孩的開米拉狀態(tài)。

由于患者沒有輸血史和移植病史，家系均為健康人群[12]，可以排除獲得性開米拉。開米拉血型通常是在血液中同時(shí)找到兩種來源的紅細(xì)胞而被發(fā)現(xiàn)的。這個(gè)男孩的血型分型為A3B3型，ABO基因型分型為B101，O01和少量的A102。A，B和O基因的cDNA的結(jié)構(gòu)高度近似[13]。O01基因只比A101基因少了一個(gè)核苷酸，即第6外顯子nt261位的G缺失，導(dǎo)致閱讀框架的移位，nt352位之后提前出現(xiàn)終止密碼子，使其在117位氨基酸翻譯后不能形成成熟的氨基酸，即該基因編碼一個(gè)截短的蛋白質(zhì)，該蛋白無催化結(jié)構(gòu)域，故O基因?yàn)殡[性基因。B101基因與A101基因的核苷酸有7個(gè)位點(diǎn)不同，即nt297，526，657，703，796，803，930。這些位點(diǎn)的差異，會導(dǎo)致4個(gè)氨基酸的改變(Arg176Gly，Gly235Ser，Leu266Met，Gly268Ala)[14]，從而表達(dá)4種不同的蛋白質(zhì)。也正是由于這4種氨基酸的改變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶GTA(α-1，3-N乙?；鵇-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TB(α-1，3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)。

在PCR擴(kuò)增過程中，數(shù)量少的細(xì)胞系會與血液中的主體細(xì)胞產(chǎn)生競爭性抑制，在常染色體STR中形成一個(gè)很小的峰。這一少量的細(xì)胞系可以通過PCR-SSP方法檢測到其特異性的等位基因，同時(shí)，在HLA-SSP基因分型以及混合培養(yǎng)的細(xì)胞克隆產(chǎn)物中，也能發(fā)現(xiàn)。此例中患者低拷貝數(shù)量的A102基因是引起AB表達(dá)異常的原因。同時(shí)由于競爭性抑制，額外峰常形成比正常峰低的峰，易漏檢；而有些常染色體STR位點(diǎn)沒有出現(xiàn)異常，有一部分原因可能是由于父源或母源中含有相同的重復(fù)數(shù)目而被掩蓋[15，16]。

由于缺少對該男孩的咽拭子、頭發(fā)毛囊、以及指甲等的進(jìn)一步分析，無法判斷該例患者是否為A102/O01，B101，/O01四倍體全身性的開米拉。四倍體開米拉是在受精過程中，由2個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)精子相互結(jié)合而形成四倍體受精卵，這一受精卵繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂，就可能產(chǎn)生多種不同來源的混合細(xì)胞系。我們對該男孩的父母的STR檢測的結(jié)果并不能區(qū)分該男孩是這兩種開米拉中的哪一種，目前暫定為血型開米拉。ABO血型開米拉現(xiàn)象在血型檢測中，僅憑借常規(guī)的檢測技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)。血型開米拉的發(fā)現(xiàn)多數(shù)血型鑒定過程中偶然發(fā)現(xiàn)的。本例血型開米拉的發(fā)現(xiàn)，使我們獲得了一次很難得的研究開米拉遺傳狀態(tài)機(jī)會。同時(shí)，這一發(fā)現(xiàn)，也為我們再遇到疑難血型以及親子鑒定的疑難結(jié)果提供了一種分析問題的思路與研究方向。

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