周浩宇，黃鳳洪，鈕琰星，黃 茜

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢430062）

固態(tài)發(fā)酵法脫除菜籽餅粕中總酚及芥子堿的工藝研究

周浩宇1，2，黃鳳洪2，*，鈕琰星2，黃 茜2

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢430062）

篩選出能高效降解菜粕中總酚及芥子堿的菌株，并進(jìn)行混合發(fā)酵，研究了不同菌株、不同菜粕原料、不同接種量、不同發(fā)酵時(shí)間、不同營(yíng)養(yǎng)源及不同金屬離子對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響。結(jié)果表明：釀酒酵母、納豆芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌B4以8%的總接種量，等比例接種到添加了5%糖蜜和0.05%的硫酸銅及硫酸亞鐵的菜籽餅粕（含水量為50%）中，發(fā)酵72h，菜粕中的總酚和芥子堿降解率可達(dá)到70.72%及80.06%。

總酚，芥子堿，菜籽餅粕，混合發(fā)酵

菜粕是數(shù)量上僅次于豆粕的植物蛋白源，我國(guó)年產(chǎn)量約有700萬(wàn)t。隨著菜籽雙低（低硫甙、低芥酸）化進(jìn)程的推進(jìn)，酚類(lèi)物質(zhì)成為菜粕中重要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。菜籽中的多酚類(lèi)化合物通常以游離酸、酯類(lèi)及不溶性化合物的形式存在，主要分為簡(jiǎn)單酚類(lèi)和多酚類(lèi)物質(zhì)。菜粕中的簡(jiǎn)單酚類(lèi)主要以芥子堿為主，多酚以單寧為主。芥子堿在中性和堿性條件下易發(fā)生氧化和聚合作用，是使菜籽粕變黑并產(chǎn)生不良?xì)馕都翱辔兜闹饕?，亦能使褐殼雞蛋產(chǎn)生魚(yú)腥味[1-3]。多酚類(lèi)化合物及其氧化物能與蛋白質(zhì)、必需氨基酸、酶和其他物質(zhì)形成絡(luò)合物，都能與蛋白質(zhì)結(jié)合，影響菜籽蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的消化吸收。菜籽多酚還能螯合金屬離子，影響動(dòng)物對(duì)金屬離子的吸收利用[4]。目前由于難以通過(guò)遺傳育種減少其在菜籽粕中的含量[5]，因此在用油菜、芥菜等其他十字花科植物飼喂家畜時(shí)應(yīng)做處理或限制用量在5%以?xún)?nèi)[6]。對(duì)菜粕多酚和芥子堿的脫除方法進(jìn)行研究，不僅能解決菜粕飼料適口性差的問(wèn)題，而且為菜粕的精深加工與利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。微生物法具有條件溫和、干物質(zhì)損失小等優(yōu)點(diǎn)，且脫毒效果好，能提高菜籽粕中蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量，從而改善菜粕的飼料效價(jià)[7]。本文從研究室保藏的對(duì)菜粕有降解作用的菌株中篩選出對(duì)多酚芥子堿降解率高的菌株，研究混合發(fā)酵在不同接種量、不同發(fā)酵時(shí)間、不同營(yíng)養(yǎng)添加劑及不同芥子堿降解劑的工藝條件下對(duì)芥子堿降解的影響，從而為菜籽餅粕生物改良技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株 研究室預(yù)先篩選并保藏的菌株（16株）；菜籽餅粕 國(guó)產(chǎn)普通菜籽預(yù)榨浸出粕，冷榨脫皮菜粕；YPD培養(yǎng)基 酵母膏1.0g，蛋白胨2.0g，麥芽浸粉1.0g，葡萄糖2.0g，蒸餾水100mL；豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基 黃豆芽20.0g，葡萄糖2.0g，水100mL，pH7.2；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖2.0g，NaCl 0.5g，水100mL，pH7.0～7.2；菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 菜籽餅粕（30目）50g，自來(lái)水50mL（含水量50%），115℃滅菌15min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同菌株對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響 將保藏的各菌株，從斜面轉(zhuǎn)接到搖瓶種子液中培養(yǎng)24h，再將種子液以5%的接種量接入到菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵基上，30℃下靜置培養(yǎng)72h，發(fā)酵完畢后60℃烘干。1.2.2 不同菜粕原料總酚及芥子堿降解率的影響 將選定的降解率較高的菌株分別從斜面轉(zhuǎn)接到搖瓶種子液中培養(yǎng)24h，再將種子液以5%的總接種量等比例接入到不同原料的菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵基上，30℃下靜置培養(yǎng)72h，發(fā)酵完畢后60℃烘干。

1.2.3 不同接種量對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響 將菌株分別從斜面轉(zhuǎn)接到搖瓶種子液中培養(yǎng)24h，再將種子液以1%、3%、5%、8%、10%的總接種量等比例接入到脫皮菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵基上，30℃下靜置培養(yǎng)72h，發(fā)酵完畢后60℃烘干。

1.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響 將菌株分別從斜面轉(zhuǎn)接到搖瓶種子液中培養(yǎng)24h，再將種子液以8%的總接種量，等比例接入到菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵基上，30℃下靜置，分別發(fā)酵培養(yǎng)24、36、48、60、72、84、96h，發(fā)酵完畢后60℃烘干。

1.2.5 不同營(yíng)養(yǎng)源對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響 在菜粕中分別添加幾種不同的營(yíng)養(yǎng)源各5%，將菌株分別從斜面轉(zhuǎn)接到搖瓶種子液中培養(yǎng)24h，再將種子液以8%的總接種量等比例接入到脫皮菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵基上，30℃下靜置培養(yǎng)72h，發(fā)酵完畢后60℃烘干。1.2.6 不同金屬離子對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響 在菜粕中分別添加CuSO4、ZnSO4、FeSO4、CaCl2各0.05%，將菌株分別從斜面轉(zhuǎn)接到搖瓶種子液中培養(yǎng)24h，再將種子液以8%的總接種量等比例接入到添加了糖蜜的脫皮菜籽餅粕固態(tài)發(fā)酵基上，30℃下靜置培養(yǎng)72h，發(fā)酵完畢后60℃烘干。

1.2.7 總酚芥子堿測(cè)定方法 總酚檢測(cè)以單寧酸為標(biāo)準(zhǔn)品，芥子堿的檢測(cè)按照BLAIR[8]的方法進(jìn)行。

總酚及芥子堿降解率：（原含量-降解后含量）/原含量

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響

由圖1可以看出，不同菌株對(duì)總酚及芥子堿的降解效果由高到低依次為酵母類(lèi)、細(xì)菌類(lèi)、霉菌類(lèi)。這可能是因?yàn)榻湍割?lèi)菌株高產(chǎn)能降解總酚及芥子堿的酶系，如多酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶等。酵母類(lèi)中釀酒酵母的降解效果最優(yōu)，其芥子堿降解率達(dá)55.41%，總酚降解率達(dá)69.66%。細(xì)菌中納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌B4脫除芥子堿效果也較為明顯，芥子堿降解率達(dá)50%左右，總酚降解率在60%左右。霉菌中變色栓菌的脫除效果遠(yuǎn)優(yōu)于其他幾株霉菌，這是因?yàn)樽兩ň墚a(chǎn)漆酶，可高效降解芥子堿。本研究室一直從事菜粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子（芥子堿、單寧、硫甙、植酸等）的生物降解研究工作，在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對(duì)菜粕中的總酚及芥子堿具有較好的脫除作用，提高菜粕中粗蛋白含量，且發(fā)酵后具有濃郁的酵香味，能改善菜籽餅粕的適口性，而納豆芽孢桿菌除了能較好地降解芥子堿外，還能分解蛋白質(zhì)為短肽，促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收；而因此將釀酒酵母、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌B4進(jìn)行混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵后總酚及芥子堿降解率明顯高于單菌。

圖1 不同菌株對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響Fig.1 The degradation of total phenolics and sinapine of different strains

2.2 不同菜粕原料總酚及芥子堿降解率的影響

表1 不同菜粕原料對(duì)發(fā)酵的影響Table 1 Effect of different rapeseed meals on fermentation

由表1可看出，普通菜粕及冷榨脫皮菜粕原料中的總酚及芥子堿含量差異不大，經(jīng)過(guò)選定的混菌發(fā)酵后，冷榨脫皮菜粕中的總酚及芥子堿含量要遠(yuǎn)低于普通菜粕。這是由于脫皮后的菜粕粗纖維含量降低，蛋白質(zhì)含量提高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易被微生物生長(zhǎng)利用，促進(jìn)抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化。因此，選用脫皮冷榨菜粕進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 不同接種量對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響

圖2 不同接種量對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響Fig.2 The degradation of total phenolics and sinapine of different inoculation amount

由圖2可知，隨著接種量的增大，芥子堿含量逐漸減少，當(dāng)三支菌株的總接種量達(dá)到8%時(shí)，總酚及芥子堿降解率分別為69.27%和78.19%。因?yàn)椴捎幂^大的接種量可以縮短菌體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使降解芥子堿的酶系提前形成；但是接種量過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響酶的形成，且不經(jīng)濟(jì)。接種總量為8%和10%時(shí)，芥子堿降解率非常接近，綜合考慮，接種量采用8%較為合適。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響Fig.3 The degradation of total phenolics and sinapine of different fermentation time

圖3結(jié)果顯示，隨著菜粕發(fā)酵時(shí)間的推移，總酚及芥子堿含量逐漸降低，發(fā)酵24～72h，芥子堿的降解效果明顯。發(fā)酵72h時(shí)，總酚及芥子堿的降解率分別達(dá)到65.36%及62.18%，72h后，芥子堿的含量雖然也在減少，但是降解效果已趨于平緩。從實(shí)際生產(chǎn)考慮，選擇72h較為合適。

2.5 添加不同營(yíng)養(yǎng)源對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響

圖4 不同營(yíng)養(yǎng)源對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響Fig.4 The degradation of total phenolics and sinapine of different nutritional additives

由圖4可看出，添加營(yíng)養(yǎng)源后總酚及芥子堿的降解率比未添加有所提高，而不同營(yíng)養(yǎng)源之間的降解效果也有差異，其中添加糖蜜后的效果最好。糖蜜含有少量粗蛋白及多種礦物質(zhì)，更含有大量可發(fā)酵糖（主要是蔗糖），因而是很好的發(fā)酵原料。另外，添加營(yíng)養(yǎng)源可促使菜粕中的其他抗?fàn)I養(yǎng)成分，如硫甙、粗纖維的降解，還可以提高粗蛋白、多肽的含量。因此，在工廠大批量發(fā)酵時(shí)可適量添加營(yíng)養(yǎng)源。

2.6 不同金屬離子對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響

由圖5可看出，添加不同的金屬離子對(duì)芥子堿降解率影響較為顯著，硫酸銅、硫酸亞鐵可促進(jìn)芥子堿的降解，氯化鈣對(duì)芥子堿降解有抑制作用；添加硫酸鋅則無(wú)影響。其中硫酸銅對(duì)芥子堿的降解效果最為明顯，降解率可達(dá)70.72%，這可能是由于銅離子能夠刺激多酚氧化酶等酶系的產(chǎn)生，而芥子堿在多酚氧化酶的酶解作用下更快分解。另外，DAS等[9]人利用不同的金屬鹽溶液（CuSO4、FeSO4、NiSO4及ZnSO2）對(duì)菜粕進(jìn)行浸泡處理，并在肉雞和豬的日糧中按體重添加80～160g/kg用CuSO4溶液處理過(guò)的菜籽餅粕，發(fā)現(xiàn)其對(duì)生長(zhǎng)、甲狀腺功能、碘的吸收、血漿中Zn含量及堿性磷酸酶活性都有很好的改善作用。因此，在餅粕中添加適量的金屬離子對(duì)發(fā)酵及動(dòng)物飼養(yǎng)效果良好。

圖5 不同金屬離子對(duì)總酚及芥子堿降解率的影響Fig.5 The degradation of total phenolics and sinapine of different metal ions

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)研究了不同菌株、不同菜粕原料、不同發(fā)酵工藝及不同添加劑對(duì)菜粕總酚及芥子堿降解率的影響，發(fā)現(xiàn)在菜粕中添加一定比例營(yíng)養(yǎng)源及硫酸銅、硫酸亞鐵，采用釀酒酵母、枯草芽孢桿菌B4和納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵，在總接種量為8%，含水量為50%，固態(tài)發(fā)酵72h時(shí)，菜粕中的總酚、芥子堿降解率可達(dá)到70.72%及80.06%。

3.2 目前，本研究室已篩選出高效降解芥子堿的菌株-釀酒酵母，并對(duì)其降解途徑和機(jī)理進(jìn)行了初步的探索，研究菌株發(fā)酵降解芥子堿的主要酶系，為微生物降解脫除菜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子提供理論基礎(chǔ)。

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Study on desorption condition of total phenolics and sinapine in rapeseed meal by solid fermentation

ZHOU Hao-yu1，2，HUANG Feng-hong2，*，NIU Yan-xing2，HUANG Qian2
（1.Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China；2.Oil Crops Research Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China）

The strains which had high efficient degradation of total phenolics and sinapine were screened out，and then the mixed fermentation carried on.The influence of different strains，different inoculation quantity，different meal raw materials，different fermentation time，different nutritional additives and different metal ions of sinapine on the total phenolics and sinapine degradation rate were studied.The results indicated that Saccharomyces cerevisiae，Bacillus natto and Bacillus subtilis B4were inoculated to the rapeseed meal culture to get the best conditions of fermentation：the total inoculation amount was 8%，the water content was 50%，the fermentation time was 72h，the nutritional additives was 5%，the metal ions was 0.05%and then rapeseed meal was expanded before fermentation.The degradation rate of total phenolics and sinapine in rapeseed meal were 70.72%and 80.06%.

total phenolics；sinapine；rapeseed meal；mixed fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2012）01-0183-03

2010－11－25 *通訊聯(lián)系人

周浩宇（1985-），女，碩士，主要從事菜粕主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的生物降解機(jī)理研究。

2010國(guó)家自然科學(xué)基金（C200303）。