股二頭肌急性拉傷動(dòng)物模型的建立

劉明燕 王大安

1 南方醫(yī)科大學(xué)體育部（廣州 510515） 2 廣州體育學(xué)院

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中股二頭肌急性拉傷較常見(jiàn)[1，2]，其具有發(fā)病率高，復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，會(huì)影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)功能，并造成運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)成績(jī)下降。因此，深入研究股二頭肌急性拉傷機(jī)制，并有效地進(jìn)行預(yù)防、治療和康復(fù)都是亟待解決的問(wèn)題。解決這些問(wèn)題，要借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究，特別是建立動(dòng)物模型闡明其病因、病理及其內(nèi)在機(jī)制，進(jìn)而找到正確的解決方法。因此，本研究模擬運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下股二頭肌的急性拉傷，建立一種反映運(yùn)動(dòng)實(shí)踐特點(diǎn)的股二頭肌急性拉傷動(dòng)物模型，提供深入研究的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性SD大鼠30只，8～12周齡，體重（340±20）克，由香港理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。先按體重分層，再用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組，傷后當(dāng)天的D0組，以及傷后第3、7、14天的D3、D7和D14組，每組6只，實(shí)驗(yàn)操作遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用準(zhǔn)則。

1.2 確立扭矩－頻率關(guān)系和角速度的控制

通過(guò)測(cè)量股二頭肌抽搐以及肌強(qiáng)直收縮確定合適的關(guān)節(jié)扭矩。刺激頻率選擇30、40、50、60、70、80、90以及100Hz，刺激持續(xù)時(shí)間為750毫秒[3]，確立扭矩與頻率的關(guān)系，并確認(rèn)扭矩峰值出現(xiàn)的頻率。經(jīng)測(cè)試，所有大鼠股二頭肌扭矩峰值均出現(xiàn)在80 Hz至100 Hz，故本實(shí)驗(yàn)選擇100 Hz的頻率刺激股二頭肌發(fā)生強(qiáng)直收縮。本實(shí)驗(yàn)選擇最大模擬伸膝擺腿角速度960°?s-1（儀器帶動(dòng)腿部擺動(dòng)）為肌肉拉伸角速度值。實(shí)驗(yàn)分別利用NATIONAL INSTRUMENTS LabVIEW 8.2系統(tǒng)和Measurement＆Automation Explorer Version 4.3系統(tǒng)控制角速度和角度。

1.3 動(dòng)物模型建立方法

以每公斤體重50毫克氯胺酮和5毫克賽拉嗪的麻醉混合劑，腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠仰臥固定于大鼠固定架上，隨機(jī)選取一側(cè)小腿固定于固定板上，固定板與集流環(huán)動(dòng)態(tài)扭矩傳感器一端連接，傳感器另一端與發(fā)動(dòng)機(jī)軸連接，保持大鼠膝關(guān)節(jié)屈伸運(yùn)動(dòng)軸心與發(fā)動(dòng)機(jī)軸在同一水平。用生理刺激儀的針電極解剖定位并刺激坐骨神經(jīng)，使固定側(cè)股二頭肌產(chǎn)生強(qiáng)直收縮，膝關(guān)節(jié)屈曲。同時(shí)，發(fā)動(dòng)機(jī)帶動(dòng)大鼠固定板，迫使膝關(guān)節(jié)迅速做角速度為960°·s-1的伸膝運(yùn)動(dòng)，范圍從屈膝70°到完全伸直位180°。在此過(guò)程中，股二頭肌離心收縮，造成急性拉傷。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)試

1.4.1 超聲診斷觀察

股二頭肌拉傷后3小時(shí)，利用UIDM-550A超聲診斷系統(tǒng)（日本Toshiba Medical Systems公司）PLM-1 202S線性診斷探頭觀察，主要了解損傷部位、損傷程度、局部出血位置及范圍等。具體操作時(shí)，先掃描肌肉縱切面，確定拉傷位置，后將探頭在垂直位旋轉(zhuǎn)90°，掃描橫切面，使用超聲診斷儀器標(biāo)尺功能確定損傷直徑與肌肉橫徑大小，兩者相除即得到損傷比例。

1.4.2 在體力矩的測(cè)定

D0、D3、D7和D14組分別于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天和第3、7、14天進(jìn)行力矩測(cè)定。將麻醉后的動(dòng)物仰臥固定于大鼠固定架上，小腿固定于固定板，固定板與集流環(huán)動(dòng)態(tài)扭矩傳感器一端連接，傳感器另一端與發(fā)動(dòng)機(jī)軸聯(lián)接，保持大鼠膝關(guān)節(jié)屈伸運(yùn)動(dòng)軸心與發(fā)動(dòng)機(jī)軸同一水平。通過(guò)運(yùn)動(dòng)控制器調(diào)整角度，測(cè)定膝關(guān)節(jié)屈伸不同角度時(shí)的力矩值。起始角度為90°，每次測(cè)試后角度增加5°，逐漸增至170°。在各個(gè)角度時(shí)，用生理刺激儀針電極刺激固定側(cè)肢體坐骨神經(jīng)，使股二頭肌強(qiáng)直收縮，膝關(guān)節(jié)屈曲壓迫固定扳，通過(guò)扭矩傳感器測(cè)定力矩大小，確定最大等長(zhǎng)力矩值，以及各組股二頭肌的最優(yōu)角度，即最大力矩值所處的角度。

1.4.3 病理組織觀察

測(cè)量力矩后，處死動(dòng)物分離股二頭肌，液氮固定，OCT（冷凍包埋劑）包埋后，在冷凍切片機(jī)內(nèi)，于肌腹中央部以及肌腱結(jié)合處選取連續(xù)切片，厚度為6 μm，將切片進(jìn)行洗滌、HE染色、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉紅色或紅色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較，方差齊時(shí)采用方差分析，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)。P<0.05或P< 0.01時(shí)，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲診斷結(jié)果

股二頭肌肌肉拉傷后，受累肌肉局部回聲減低，部分撕裂聲像圖顯示肌纖維部分或完全不連續(xù)，裂口出現(xiàn)血腫，或表現(xiàn)為肌纖維束之間距離異常。損傷位置處于遠(yuǎn)端肌腱結(jié)合部靠近肌肉端。表1顯示，拉傷3小時(shí)后，D0組、D3組、D7組和D14組的損傷比例組間比較無(wú)顯著性差異（P> 0.05）。

表1 各組股二頭肌拉傷后超聲診斷損傷比例

2.2 力矩測(cè)試結(jié)果

2.2.1 不同時(shí)刻最大等長(zhǎng)力矩指標(biāo)的變化

表2顯示，正常對(duì)照組股二頭肌最大等長(zhǎng)力矩值為（0.337±0.025）Nm。D0組關(guān)節(jié)最大等長(zhǎng)力矩下降至（0.246±0.026）Nm，D3組為（0.268±0.028）Nm，D7組為（0.303±0.024）Nm，三組與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異（P< 0.05），D14組基本恢復(fù)正常。

2.2.2 股二頭肌最優(yōu)角度

正常對(duì)照組最優(yōu)角度出現(xiàn)在（130.00±3.54）°。D0組關(guān)節(jié)最優(yōu)角度變大，為（144.50±3.71）°，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（P< 0.01，圖1）。D14組最優(yōu)角度變小，為（120.00±3.53）°，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（P< 0.05，圖2）。

表2 各組最大等長(zhǎng)力矩測(cè)試結(jié)果

2.3 光鏡觀察

鏡下可見(jiàn)，正常股二頭肌肌纖維橫切面呈多角形，細(xì)胞核位于外周，肌間隙及肌漿內(nèi)未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌漿染色均勻，間隙內(nèi)無(wú)出血，肌纖維無(wú)壞死（圖3A）。D0組可見(jiàn)肌纖維內(nèi)有肌纖維崩解、壞死，肌肉組織結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維水腫變性，肌肉間隙大小不一，部分肌纖維間隙明顯加大，并可見(jiàn)血管擴(kuò)張充血（圖3B）。D3組可見(jiàn)肌纖維內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及肌纖維壞死，肌肉組織結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維水腫變性，肌肉間隙大小不一（圖3C）。D7組肌纖維出現(xiàn)修復(fù)，但是肌纖維形態(tài)表現(xiàn)不成熟，明顯可見(jiàn)肌纖維完全分裂的小肌纖維或成簇狀緊貼于成熟肌纖維外周的小肌纖維，肌肉組織結(jié)構(gòu)紊亂，肌肉間隙大小不一。肌纖維具有中央核或近中央核。肌纖維成簇分布，圓形，體積?。▓D3D）。D14組肌纖維基本修復(fù)（圖3E）。

3 討論

3.1 股二頭肌急性拉傷動(dòng)物模型的建立方法

肌肉拉傷是肌肉承受的負(fù)荷超過(guò)其本身承受能力而導(dǎo)致的損傷，肌肉拉傷動(dòng)物模型均基于這一理論構(gòu)建。主動(dòng)收縮或被動(dòng)牽拉都可導(dǎo)致肌肉損傷，但兩者引起的肌肉組織損傷性質(zhì)不一，其中包括損傷位置和病理改變等的差異[4-6]，而且，這兩種狀態(tài)下參與收縮的肌肉成分有所不同。有實(shí)驗(yàn)研究[7]為此提供了直接依據(jù)，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)收縮造成的肌肉損傷以肌纖維（即收縮成分）為主，只有加載到肌組織上的負(fù)荷足夠大時(shí)才會(huì)造成連接組織（即彈性成分）的損傷。也有實(shí)驗(yàn)[8，9]證實(shí)，不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下骨骼肌的生物力學(xué)特征不相同，被動(dòng)牽拉與主動(dòng)收縮造成的肌肉病理改變有些不同。因此，肌肉拉傷時(shí)的不同狀態(tài)造成拉傷后肌肉特性的差異。在高速度運(yùn)動(dòng)或需快速加速的運(yùn)動(dòng)中，股二頭肌拉傷最常見(jiàn)，如短跑、足球、橄欖球和籃球等最多見(jiàn)[10，11]，其中尤以短跑發(fā)病率最高。據(jù)測(cè)量，100米跑時(shí)，運(yùn)動(dòng)員膝關(guān)節(jié)伸膝角速度在 860°?s-1～ 1146°?s-1[12]，足球運(yùn)動(dòng)員優(yōu)勢(shì)腿最大伸膝擺腿角速度為960°?s-1～ 1135°?s-1[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最大伸膝擺腿角速度960°?s-1為肌肉拉伸角速度值。

此外，肌肉拉傷時(shí)的運(yùn)動(dòng)方式也是建立動(dòng)物模型的一個(gè)重要的影響因素。臨床上，肌肉拉傷可由對(duì)肌肉的多次反復(fù)牽拉或者一次性拉伸引起，因此，很多學(xué)者采用反復(fù)多次牽拉[9、14]或者一次性拉伸[15]方法建立動(dòng)物模型，這為本實(shí)驗(yàn)提供了很好的參考。肌肉拉傷動(dòng)物模型必須符合本身的損傷特點(diǎn)。研究觀察到，采用一次性牽拉造成的肌肉拉傷特性與臨床急性拉傷特點(diǎn)符合，而反復(fù)牽拉造成的肌肉損傷則更反映臨床慢性肌肉損傷特點(diǎn)[16，17]。運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中，股二頭肌拉傷最常見(jiàn)于需要高速度或迅速加速的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目，屬于較常見(jiàn)的急性拉傷。其次，股二頭肌損傷時(shí)，肌肉一般處于離心收縮狀態(tài)，單純被動(dòng)牽拉并不多見(jiàn)。在收縮速度相同的情況下，同一塊肌肉做離心收縮時(shí)可產(chǎn)生最大的張力。這種情況下，肌肉承受的負(fù)荷更容易超過(guò)其最大承受能力，從而也容易引起肌肉損傷[18，19]。建立股二頭肌急性拉傷動(dòng)物模型應(yīng)符合上述運(yùn)動(dòng)實(shí)踐特點(diǎn)，不僅選擇肌肉主動(dòng)的離心收縮狀態(tài)與拉傷方式，還要選擇符合人體在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中的拉伸速率。因此，本研究采用針電刺激坐骨神經(jīng)，使固定側(cè)肢體的股二頭肌發(fā)生強(qiáng)直收縮，膝關(guān)節(jié)發(fā)生屈曲趨勢(shì)。同時(shí)，發(fā)動(dòng)機(jī)帶動(dòng)大鼠固定板，迫使膝關(guān)節(jié)迅速做角速度960°?s-1伸膝運(yùn)動(dòng)，構(gòu)建在體股二頭肌急性拉傷動(dòng)物模型，客觀反映股二頭肌急性拉傷的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)。

3.2 股二頭肌急性拉傷組織病理改變及組織修復(fù)

以往研究[20]中，骨骼肌組織損傷之后，光鏡下可見(jiàn)肌纖維崩解、壞死，肌肉組織結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維水腫變性，肌肉間隙大小不一，部分肌纖維間隙明顯加大，并可見(jiàn)血管擴(kuò)張充血。隨后，組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為肌纖維壞死、出血、腫脹和炎細(xì)胞聚集與浸潤(rùn)。然后，骨骼肌損傷后的修復(fù)過(guò)程始于炎癥，炎癥細(xì)胞滲出處理壞死的細(xì)胞、組織碎片。損傷發(fā)生之后1周左右，水腫與炎癥反應(yīng)逐漸被吸收，損傷組織肌纖維再生和肌管形成，成纖維細(xì)胞十分活躍[21]。這種病理改變過(guò)程與本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果相符，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)造成的股二頭肌拉傷能夠反映肌肉損傷的一般規(guī)律。

臨床上，股二頭肌拉傷部位多見(jiàn)于肌腱結(jié)合部附近，因此位置力量比較集中[22]。本研究采用組織學(xué)及診斷超聲方法同樣觀察到肌纖維斷裂發(fā)生在靠近肌肉－肌腱連接處的肌肉端。這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所造成的股二頭肌損傷能反映損傷部位的臨床特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)肌肉急性拉傷后當(dāng)天，超聲影像表現(xiàn)為受累股二頭肌局部回聲減低，部分撕裂聲像圖顯示肌纖維部分或完全不連續(xù)，裂口間出現(xiàn)血腫。但半腱肌與半膜肌的診斷超聲影像無(wú)明顯改變。這也與運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中大腿后肌群拉傷時(shí)觀測(cè)的結(jié)果一致[1，2]，故本動(dòng)物模型在這方面也體現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中股二頭肌拉傷的特點(diǎn)。之所以有此特點(diǎn)，可能與股二頭肌的解剖特點(diǎn)有關(guān)。股二頭肌位于股后部外側(cè)，由長(zhǎng)、短兩個(gè)頭組成。從坐骨神經(jīng)內(nèi)側(cè)發(fā)出的肌支支配股二頭肌長(zhǎng)頭，腓總神經(jīng)支配短頭。由于長(zhǎng)、短頭受不同神經(jīng)支配，從而導(dǎo)致不同步刺激，降低了股二頭肌控制肌肉負(fù)荷而產(chǎn)生有效張力的能力，因此股二頭肌較容易損傷。另外，各組損傷后的股二頭肌損傷比例無(wú)差異，說(shuō)明本方法建立的動(dòng)物模型有較好的可重復(fù)性。

3.3 股二頭肌拉傷后力學(xué)變化

肌肉組織損傷后，肌肉力量下降。在骨骼肌肉系統(tǒng)中，肌肉收縮產(chǎn)生力矩，從而使關(guān)節(jié)產(chǎn)生活動(dòng)。因此，力矩是常用的評(píng)價(jià)測(cè)試肌肉功能的指標(biāo)，在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中都廣泛應(yīng)用[23]。本研究結(jié)果顯示，大鼠肌肉拉傷后即刻（D0組）關(guān)節(jié)最大等長(zhǎng)力矩下降至（0.246±0.026）Nm，說(shuō)明損傷導(dǎo)致功能下降。另外，肌肉損傷后，力量－長(zhǎng)度關(guān)系曲線右移被認(rèn)為是評(píng)價(jià)肌肉損傷程度的一個(gè)指標(biāo)，偏移越大則肌肉損傷程度越重。反之，則肌肉損傷程度輕[24]。肌肉損傷后，在關(guān)節(jié)角度和力矩方面，表現(xiàn)為角度－力矩關(guān)系曲線右移和力矩值下降[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，損傷后在力矩下降的同時(shí)，角度－力矩關(guān)系曲線右移，這主要是損傷肌纖維被過(guò)度牽拉出現(xiàn)損傷和斷裂造成的。隨著損傷肌肉組織的修復(fù)，肌纖維斷端被肉芽組織填充，并有疤痕形成。該部位失去原有的肌纖維彈性，從而最優(yōu)角度下降。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了股二頭肌急性拉傷動(dòng)物模型，反映了肌肉拉傷的特點(diǎn)，并有可重復(fù)性?？刹捎帽緦?shí)驗(yàn)建立的股二頭肌拉傷動(dòng)物模型進(jìn)一步分析和探討大腿后群其它肌肉在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中的損傷特點(diǎn)和規(guī)律，加強(qiáng)肌肉損傷機(jī)制的研究，為有效預(yù)防和治療運(yùn)動(dòng)損傷提供依據(jù)。

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