鄒美圣 劉 凌 劉 澤 (廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院干部病房五科，廣東 廣州 510010)

炎性衰老中的促炎性反應(yīng)與老年相關(guān)疾病如動脈粥樣硬化(AS)等密切相關(guān)〔1〕。在炎癥反應(yīng)中，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等因素可促進(jìn)白細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。在這些炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的過程由細(xì)胞表面的細(xì)胞黏附分子所介導(dǎo)。整合素αvβ3表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的滾動速率，介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附參與炎癥反應(yīng)〔2，3〕。目前，在AS發(fā)病中研究較多的細(xì)胞黏附分子主要有細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子(VCAM-1)、E-選擇素(E-sel)和 P-選擇素(P-sel)等，而整合素αvβ3則鮮有報道。本研究旨在探討在AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs衰老中整合素αvβ3表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVECs由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、AngⅡ、CCK-8購自美國Sigma公司;細(xì)胞周期流式細(xì)胞分析試劑盒、細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑公司;兔抗整合素αvβ3單克隆抗體(CST公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自聚研生物科技公司，BCA蛋白試劑盒(Thermo scientific公司);PVDF膜、ECL發(fā)光液(Millipore，美國);倒置顯微鏡(Olympus公司，日本);酶標(biāo)儀(Tecan Genios，瑞士);流式細(xì)胞儀(Miltenyi公司，德國)，Quantity One凝膠圖像處理軟件(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的培養(yǎng)和鑒定 HUVECs細(xì)胞株貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液一次維持細(xì)胞良好生長狀態(tài)。待細(xì)胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVECs呈多角形，單層鋪路石樣緊密排列。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以5 000個/孔接種于96孔板中，每孔加100 μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱過夜，棄去培養(yǎng)液后，對照組(5孔)每孔加入100 μl培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組(每組5孔)加入含不同濃度(10－8、10－7、10－6和 10－5mol/L)AngⅡ100 μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前向每孔加入CCK-8 20 μl培養(yǎng)1 h，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm下測定各孔OD值，以藥物組與對照組OD值百分比代表細(xì)胞增殖率。每組設(shè)5復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 衰老細(xì)胞鑒定 細(xì)胞長至亞融合后，無血清同步12 h，加入終濃度為10－6mol/L AngⅡ，持續(xù)刺激48 h，第12、24小時各補(bǔ)充AngⅡ一次即為AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs衰老模型。對照組為不含AngⅡ上述培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.2.3.1 β-半乳糖苷酶染色 根據(jù)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒操作方法，將原培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液棄去，PBS清洗細(xì)胞1次，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 ml，室溫固定15 min。吸除固定液后PBS洗3次，每次3 min。每孔加入染色工作液1 ml，37℃無CO2條件下孵育過夜。用保鮮膜將六孔板封住以防止蒸發(fā)。熒光顯微鏡下每組標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，胞漿藍(lán)染者為衰老細(xì)胞，計算衰老細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.3.2 細(xì)胞周期分析 收獲的細(xì)胞冷乙醇4℃固定過夜。取5×106細(xì)胞，1 000 r/min離心棄乙醇，PBS洗兩遍;加入碘化丙啶(PI)染液，4℃避光孵育30 min。過篩后立刻上機(jī)檢測進(jìn)行細(xì)胞流式周期分析。

1.2.4 Western印跡檢測整合素αvβ3水平 收集AngⅡ誘導(dǎo)0、12、24、36、48 h 細(xì)胞，用冷 PBS 洗 2 次，加入預(yù)冷的含 1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上充分裂解細(xì)胞30 min，4℃、離心30 min取上清分裝，加入2倍上樣緩沖液沸水變性5 min，－20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)BCA蛋白濃度定量試劑盒操作說明測定蛋白樣品濃度，每個樣品上樣量為20 μg，蛋白經(jīng)過12%SDSPAGE凝膠電泳，100 V、2 h，分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST室溫下緩慢搖動封閉1 h，加入一抗，在4℃孵育過夜，TBST洗滌后，與二抗室溫孵育1 h，常規(guī)洗膜化學(xué)發(fā)光試劑顯色，X線片顯影，計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)對X線片上顯影的條帶進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以s表示，計量資料比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率 CCK-8法檢測表明，經(jīng)不同濃度AngⅡ培養(yǎng) HUVECs 48 h 后，10－8和 10－7mmol/L AngⅡ組細(xì)胞存活率〔(91.67±4.23)%、(86.67±5.06)%〕與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05);10－6mmol/L AngⅡ組和 10－5mmol/L AngⅡ組存活率〔(97.15±1.85)%、(55.61±7.92)%〕比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。10－5mmol/L AngⅡ在48 h即引起細(xì)胞生長停滯，增殖率降低，從而可能因濃度過高而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，不能誘發(fā)細(xì)胞衰老;10－8mmol/L AngⅡ組和10－7mmol/L AngⅡ在48 h內(nèi)仍未引起明顯的細(xì)胞生長停滯，從而可能因濃度過低不至于引起細(xì)胞衰老;10－5mmol/L AngⅡ組細(xì)胞存活率為(77.15±1.85)%，故本實(shí)驗(yàn)選用10－6mol/L AngⅡ建立HUVECs衰老模型。

2.2 衰老細(xì)胞鑒定

2.2.1 SA-β-gal活性 SA-β-gal化學(xué)染色陽性細(xì)胞的胞漿和胞核呈藍(lán)染。染色前用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。對照組HUVECs生長良好，呈多角形或梭形;AngⅡ誘導(dǎo)組HUVECs體積較大，形態(tài)不一，胞漿中可見較多顆?；蚩张荨Ｈ旧髮φ战M幾乎不表達(dá)β-gal，AngⅡ誘導(dǎo)組β-gal陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，約80%細(xì)胞染色陽性。見圖1。

2.2.2 細(xì)胞周期分析 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，對照組HUVECs的各期比例正常，AngⅡ誘導(dǎo)大部分細(xì)胞停滯于G0/G1期，S期及G2/M期趨于消失(表1)，與對照組比較各周期的細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=92.329，P＜0.01)。表明誘導(dǎo)組細(xì)胞生長逐漸停滯，細(xì)胞增殖能力明顯下降。

圖1 AngⅡ?qū)UVECs形態(tài)及SA-β-gal活性的影響

表1 AngⅡ?qū)?xì)胞周期的影響(%， s，n=5)

表1 AngⅡ?qū)?xì)胞周期的影響(%， s，n=5)

與對照組比較：1)P＜0.01

組別 G0/G1期 S期 G2/M期49.5±5.5 31.0±5.3 19.4±1.7 AngⅡ誘導(dǎo)組 89.4±3.41) 8.0±3.11) 2.0±1.51)對照組

2.3 整合素αvβ3的表達(dá) Western印跡法顯示，HUVECs靜息時表達(dá)少量的整合素αvβ3，AngⅡ呈時間依賴性地上調(diào)整合素αvβ3表達(dá)，AngⅡ誘導(dǎo) HUVECs 12 h，整合素 αvβ3表達(dá)逐漸增高，48 h整合素 αvβ3表達(dá)是 0 h的 1.5倍(F=72.582，P ＜0.01)。見圖2。

圖2 AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs整合素β3表達(dá)電泳圖

3 討論

目前血管緊張素系統(tǒng)在血管衰老機(jī)制研究中逐漸被重視，AngⅡ信號級聯(lián)反應(yīng)隨衰老增加，最終促進(jìn)AS的發(fā)展，抑制AngⅡ的活性已被證明能降低心血管疾病的發(fā)病率和病死率〔4〕。AngⅡ信號在調(diào)節(jié)血管老化的許多刺激和信號中有關(guān)鍵性作用。最近研究表明，AngⅡ可通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老〔5〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AngⅡ誘導(dǎo)組內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-gal活性與對照組相比明顯增高，與本課題組前期研究AngⅡ可呈劑量依賴性直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老相吻合。AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞停滯G0/G1期，而S期及G2/M期趨于消失，表明細(xì)胞分裂緩慢，細(xì)胞增殖能力逐漸消失，該結(jié)果與Unterluggauer等〔6〕報道的內(nèi)皮細(xì)胞衰老后細(xì)胞周期分布特點(diǎn)相符，說明用AngⅡ誘導(dǎo)的方法已成功復(fù)制衰老的HUVECs模型，可用于細(xì)胞衰老機(jī)制的研究。

整合素αvβ3是與AS相關(guān)的重要黏附因子之一。研究表明整合素αvβ3可以介導(dǎo)白細(xì)胞〔7〕和嗜酸性粒細(xì)胞〔8〕黏附于培養(yǎng)的HUVECs。Bishop等人〔9〕證實(shí)在高糖促進(jìn)單核細(xì)胞和白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附增加的機(jī)制中，整合素αvβ3起主要中介作用，杜學(xué)良等〔10〕人的研究表明，HG能夠活化內(nèi)皮細(xì)胞，使整合素αvβ3表達(dá)增加，同時內(nèi)皮細(xì)胞與血小板黏附增加。同型半胱氨酸和氧化低密度脂蛋白在切應(yīng)力作用時，可使血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附增加2～3倍，這個現(xiàn)象可顯著地被整合素αvβ3拮抗劑所阻斷〔11〕。本研究表明AngⅡ呈時間依賴性地上調(diào)整合素αvβ3表達(dá)，與文獻(xiàn)結(jié)果相吻合。

另有Kim等〔12〕提出AngⅡ作用后的血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附作用增加，而且與一些主要的黏附因子如E-selectin，VCAM-1和ICAM-1無關(guān)，但與高糖(HG)和弱氧化低密度脂蛋白(mmLDL)促進(jìn)黏附增加可能通過同一黏附因子。但本課題組前期研究觀察到AngⅡ可呈劑量依賴性地增加E-sel及P-sel的表達(dá)。為什么會出現(xiàn)上述結(jié)果不一致，主要與各種黏附分子的功能有關(guān)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 Frannceschi C，Valensin S，Lescai F，et al.Neuroinflammation and the genetics of Alzheimer's disease：the search for a pro-inflamatory phenotype〔J〕.Aging(Milano)，2001;13(3)：163-70.

2 Zarbock A，Ley K.Mechanisms and consequences of neutropil interaction with the endothelium〔J〕.Am J Pathol，2008;172(1)：1-7.

3 Rose DM，Alon R，Ginsberg MH.Intergrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration〔J〕.Immunol Rev，2007;218(1)：126-34.

4 Najjar SS，Scuteri A，Lakatta EG.Arterial aging：is it an immutable cardiovascular risk factor〔J〕?Hypertension，2005;46(3)：454-62.

5 Shan HY，Bai XJ，Chen XM.AngiotensinⅡinduces endothelial cell senescence via the activation of mitogen-activated protein kinases〔J〕.Cell Biochem Funct，2008;26(4)：459-66.

6 Unterluggauer H，Hütter E，Voglauer R，et al.Identification of cultivation independent markers of human endothelial cell senescence in vitro〔J〕.Biogerontoltgy，2007;8(4)：383-97.

7 Piali L，Hammel P，Uherek C，et al.CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium〔J〕.J Cell Biol，1995;130(2)：451-60.

8 Chiba R，Nakagawa N，Kurasawa K，et al.Ligation of CD31(PECAM-1)on endothelial cells increases adhesive function of alpha v beta3 integrin and enhances beta1 integrin-mediated adhesion of eosinophils to endothelial cells〔J〕.Blood，1999;94(4)：1319-29.

9 Bishop GG，McPherson JA，Sanders JM，et al.Selective alpha(v)beta(3)-receptor blockade reduces macrophage infiltration and restenosis after balloon angioplasty in the atherosclerotic rabbit〔J〕.Circulation，2001;103(14)：1906-11.

10 杜學(xué)良，孫 瑛，陳 莉，等.高糖、高胰島素對血管內(nèi)皮黏附功能的影響〔J〕. 中國病理生理雜志，1998;14(1)：66.

11 Dardik R，Varon D，Tamarin I，et al.Homocysteine and oxidized low density lipoprotein enhanced platelet adhesion to endothelial cells under flow conditions：distinct mechanisms of thrombogenic modulation〔J〕.Thromb Haemost，2000;83(2)：338-44.

12 Kim JA，Berliner JA，Nadler JL.AngiotensinⅡincreases monocyte binding to endothelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1996;226：862.