丁效東，張 林，李淑儀，馮 固*

(1中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，植物－土壤相互作用教育部重點開放實驗室，北京100194;2廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣東廣州510650)

豆科植物根際微生態(tài)系統(tǒng)中共同繁衍著大量的叢枝菌根(arbuscular mycorrhizae，AM)真菌和根瘤菌，它們在長期進化過程中與豆科植物形成了AM真菌－豆科植物－根瘤菌三重共生的關(guān)系［1－3］，這種共生體具有很重要的農(nóng)業(yè)和生態(tài)意義［4］。早在高等植物沒有出現(xiàn)以前，菌根真菌已與古老的陸生植物形成共生體，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中扮演著至關(guān)重要的角色［5］。與AM真菌相比，根瘤菌(rhizobia)的共生起源要晚得多，約為距今0.65億年前的白堊紀［6］。根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，能與豆科植物形成高度?；墓采P(guān)系，侵染豆科植物根部形成根瘤，進而固定空氣中的分子態(tài)氮形成能被植物利用的有機氮。在磷缺乏土壤中，特別是難溶性磷含量高的土壤，磷的吸收成為固氮豆科作物生長和結(jié)瘤固氮過程中一個限制因素［7］。在低磷土壤中，AM真菌通過對土壤中磷營養(yǎng)的吸收，滿足根瘤生長和固氮作用對磷的需求［7－8］，但是當AM真菌缺乏時將導致大豆根瘤固氮減少，甚至完全被抑制［9］。

在AM真菌－豆科植物－根瘤菌共生體系中，每種微生物活性的改變都會影響另一種微生物的生存和發(fā)展［10］。研究表明，根瘤信號(根瘤因子)刺激AM真菌對寄主的侵染［11］。菌根真菌是否直接抑制了部分根瘤的固氮活性而同時又促進了另一部分根瘤的活性?即抑制了一些衰老的根瘤的活性而促進幼小、活性強的根瘤的固氮活性。Ruiz-Lozano等［12］在研究大豆根瘤過早衰老的現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)，干旱條件下，同時接種摩西球囊霉(G.mosseae)比單接種大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)提高了大豆的結(jié)瘤量、植株體內(nèi)乙炔還原酶的活性、豆血紅蛋白和其它蛋白的含量，從而避免了大豆根瘤過早衰老。

到目前為止，AM真菌對根瘤的形成、分布所起的生態(tài)作用研究較少。我們提出的問題是，在缺磷條件下，雙接種能夠提高對氮、磷的吸收，但是是否AM真菌在根瘤的形成以及根瘤在整個根系中的分布中起到重要的生態(tài)功能作用。為此，本實驗利用沙培試驗研究根瘤的形成、分布是否依賴于AM真菌的侵染和調(diào)控，以期明確AM真菌與根瘤菌雙接種對根瘤數(shù)量、分布以及吸磷效率的影響。

1 材料與方法

1.1 供試植物

大豆(Glycine max L.Merr)種子由中國農(nóng)業(yè)大學曲周試驗站提供，品種為冀豆6號。種子經(jīng)10%的H2O2浸泡10 min滅菌，70%乙醇滅菌3～5 min，以無菌水沖洗7～8次。轉(zhuǎn)移至底部鋪有滅菌濕紗布托盤中，上部蓋一層無菌濕紗布，置于27℃避光催芽，間歇用無菌水沖洗種子(3次/日)以保持濕度。

1.2 接種劑及接種方法

供試根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum，簡寫為BJ)由中國農(nóng)業(yè)大學生物學院根瘤菌分類課題組提供。將供試菌株先接到Y(jié)MA斜面活化，然后轉(zhuǎn)接于含有培養(yǎng)液的三角瓶中。培養(yǎng)液化學組成(mmol/L):K2HPO42.87、NaCl 1.71、CaSO41.47、MgSO40.81、MnSO46.67 × 10－5、Na2MoO44.88 ×10－5、H3BO31.62 × 10－4、C6H5O7Fe 2.96 × 10－5、CH2OH(CHOH)4CH2OH 27.45、蔗糖14.61、酵母浸膏1 g/L。震蕩(轉(zhuǎn)速為200 r/min，28℃)過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，測其OD600值，計算含菌量(菌數(shù)約109個/mL)。接種方法:待大豆種子發(fā)芽至3～4 mm時，浸泡于根瘤菌菌液5 min;播種之后，于芽根處將10 mL根瘤菌菌液倒入到根部。在不接種和單接種AM真菌的處理中加入10 mL滅菌(121℃，45 min)的根瘤菌菌液。

供試 AM 真菌［Glomus mosseae(Nicol.＆Gerd.)Gerdemann ＆ Trappe，BEG167，簡寫為 GM］由北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所擴繁。接種劑為含有宿主植株根段和根外菌絲體的砂土混合物，然后通過蔗糖離心獲得大量孢子，每盆利用大約1000個孢子在大豆根系周圍進行接種。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗于2009年在中國農(nóng)業(yè)大學植物營養(yǎng)溫室中進行，培養(yǎng)室溫度30±3℃白天/24±3℃夜晚，相對濕度為50%～60%。采用石英砂培養(yǎng)，石英砂高壓蒸汽滅菌2次，每次121℃高壓蒸汽滅菌45 min。盆缽為直徑0.20 m、深度為0.15 m的塑料盆，每盆裝入石英砂1.5 kg，在盆缽中部加200 g/盆的磷礦粉(產(chǎn)地為云南省，P2O5含量≥30.0%，滅菌2次，每次121℃高壓蒸汽滅菌45 min)。

采取完全隨機設(shè)計，共設(shè)4個處理:1)不接種處理(對照，CK);2)單接AM真菌處理(G.mosseae，GM);3)單接根瘤菌處理(B.japonicum，BJ);4)根瘤菌與真菌雙接種處理(G.mosseae/B.japonicum，GM/BJ)。每個處理8個重復。

挑選發(fā)芽一致的大豆種子播于盛有石英砂的塑料盆中，每盆播種3粒種子，待幼苗長至3 cm時，留1株;大豆發(fā)芽后，第1天用1/10的營養(yǎng)液，第2天澆1/5濃度的營養(yǎng)液，然后每天澆全營養(yǎng)液至底部有營養(yǎng)液流出。營養(yǎng)液組成(mmol/L):NH4Cl 1.5、KH2PO40.1、CaCl22.5、K2SO42、MgSO42。鐵和其它微量元素含量與完全Hoagland營養(yǎng)液相同。溶液pH用KOH和HCl調(diào)至6.5±0.1。為了防止鹽分積累，每2 d用去離子水淋洗1次。

1.4 樣品采集與測定

植株分2次收獲(接種后第28 d和第56 d)。各個處理第28 d收獲4個重復，測定根系，地上部，根瘤中的氮、磷含量和主根、結(jié)根瘤的側(cè)根，無根瘤的側(cè)根中AM真菌的侵染率;其余4個重復第56 d收獲測定生物量，不同部位(根系、地上部、根瘤)中的氮、磷含量和根系中(主根、結(jié)根瘤側(cè)根、無根瘤側(cè)根)AM真菌的侵染率、固氮酶活性。

鮮重、干重、根瘤數(shù)統(tǒng)計 植株用去離子水沖洗，分為地上、根和根瘤(主根根瘤、側(cè)根根瘤)3部分，用吸水紙吸干表面水分，測定鮮重(FW)、根瘤數(shù)。再將部分鮮樣放在烘箱中105℃殺青0.5 h，80℃烘干，稱干重(DW)，然后將植株磨碎。

植株氮、磷分析 植株全磷含量測定:烘干后的地上部植株樣品經(jīng)粉碎，稱取0.3 g左右，H2SO4－H2O2法消煮，釩鉬黃吸光光度法測定植物全磷含量。植株全氮測定:采用 H2SO4－H2O2凱氏定氮法［13］。

真菌根段侵染率 采用Philipps和Hayman的方法［14］將洗凈的大豆主根、側(cè)根(結(jié)根瘤、無根瘤)根段分別切成1 cm長，10%KOH溶液浸泡，90℃水浴中12～15 min，沖洗3次后，加入2%(v/v)HCl溶液浸泡5 min，然后直接加入0.05%曲利苯藍，90℃水浴30 min，水洗。置于盛有乳酸甘油溶液的培養(yǎng)皿脫色。取30條根段制片，在100～400×的顯微鏡下觀察，并“MYCOCALC”軟件計算真菌的根段侵染率［15］。

根瘤固氮酶活性 固氮酶活性采用乙炔還原法［16］，用氣相色譜分析儀測定。將豆科植物植株剪掉地上部分，用去離子水洗凈，用吸水紙吸干，將結(jié)瘤的根系部分分別剪開，從主根和側(cè)根根瘤直接剝下(0.5 h內(nèi)采集根瘤)，按照成熟度分別選擇一系列根瘤，分別取5個根瘤測定根瘤鮮重，每個處理4次重復。裝入提前準備好的5 mL的青霉素小瓶中;然后按瓶子中氣相體積用注射器從瓶中抽出1 mL的空氣，再用注射器注入等體積的C2H2，28℃保溫2 h，準確記時并記錄;取出瓶子，用注射器吸出100 μL的混合氣體，用氣相色譜儀以外標法測定其固氮酶活性。乙烯含量氣體利用用氣相色譜儀［日本島津公司生產(chǎn)的氣相色譜GC－14B(FID)］測定條件如下:柱溫80℃，進樣口溫度100℃，檢測器溫度150℃，載氣流量50 mL/min，氫氣流量50 mL/min，空氣流量500 mL/min，保存數(shù)據(jù)并計算。每個處理重復3次。固氮酶活性用單位重量的根瘤在單位時間內(nèi)還原乙炔，生成乙烯的毫摩爾數(shù)來表示，固氮酶活［mmol/(g·h)］=C2H4(mmol)/［鮮瘤重(g)×反應(yīng)時間(h)］，根據(jù)氣體的摩爾數(shù)與體積、溫度、壓力的關(guān)系:C2H4(mmol)=C2H4的體積(mL)/22.4×273/(273+t℃)×P/760。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用 SASTM軟件(SAS Institute Inc.，1989)進行單因素顯著性檢驗。用LSD法在0.05水平進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種處理對植株生長的影響

無論接種后28 d還是56 d，大豆單接種菌根真菌與單獨接種根瘤菌相比，根系和地上部生物量(DW)都沒有顯著性差異(表1)?？墒?，與單獨接種AM真菌或根瘤菌相比，雙接種顯著提高了根系和地上部生物量(P＜0.05)。單獨接種菌根真菌或根瘤菌的植株根系和地上部生物量高于不接種處理(對照)(表1)。結(jié)果表明，AM真菌與根瘤菌的互作對植株生長起到促進作用。

2.2 不同接種處理對根瘤生長及分布的影響

在2次收獲時，與單獨接種根瘤菌相比，雙接種處理顯著增加了主根根瘤的數(shù)目(圖1A)。接種28 d時，單獨接種根瘤菌與雙接種處理相比，側(cè)根根瘤數(shù)量沒有顯著性差異?？墒?，接種56 d時，雙接種處理側(cè)根根瘤數(shù)量顯著高于單獨接種根瘤菌根瘤數(shù)量(圖1A)。2次收獲時雙接種處理各個直徑根瘤數(shù)量都顯著高于單獨接種根瘤菌時對應(yīng)直徑的根瘤數(shù)量(圖1A)。

表1 菌根真菌與根瘤菌不同接種處理對大豆生長的影響Table 1 Effects of G.mosseae and/or B.japonicum inoculations on soybean biomass at 28thand 56thday after inoculation

菌根真菌接種與單獨接種根瘤菌相比，并沒有增加主根上根瘤的生物量;相反，雙接種處理時側(cè)根根瘤生物量顯著高于單獨接種根瘤菌處理時，而且在接種處理56 d時顯著高于接種28 d收獲時(圖1B)。

另外，無論是接種28 d還是接種56 d，單獨接種根瘤菌處理時側(cè)根根瘤數(shù)量占總根瘤數(shù)量的比例與主根根瘤數(shù)量所占比例沒有顯著性差異。雙接種處理28 d時，側(cè)根中根瘤數(shù)量所占比例總是低于主根所占比例，可是，接種56 d時正好相反。在單獨接種根瘤菌時，無論接種28 d還是接種56 d，主根根瘤生物量所占總生物量比例與側(cè)根根瘤生物量所占總生物量比例沒有顯著差異。雙接種處理時側(cè)根上根瘤生物量所占總生物量比例高于主根上根瘤生物量所占總生物量比例(圖1C)。

圖1 菌根真菌與根瘤菌不同接種處理對大豆根瘤數(shù)量和大小分布、生物量以及在根系中比例的影響Fig.1 Effects of the inoculations on numbers and distribution between 5 diameter classes，biomass and proportion of nodules in the taproots and lateral roots of soybeans at 28thand 56thday after inoculation

2.3 不同接種處理對根瘤固氮酶活性的影響

接種28 d時，單接種根瘤菌時側(cè)根根瘤的固氮酶活性顯著低于主根根瘤的固氮酶活性，但是雙接種處理時主根與側(cè)根的根瘤固氮酶活性沒有顯著差異(圖2)。接種56 d時，單接種根瘤菌處理的側(cè)根根瘤的固氮酶活性與主根根瘤的固氮酶活性沒有顯著差異，但是雙接種處理中主根根瘤固氮酶活性顯著低于側(cè)根根瘤固氮酶活性。接種28 d和56 d時，雙接種處理的主根和側(cè)根的根瘤固氮酶活性均高于單接種處理的根瘤固氮酶(圖2)。

圖2 接種處理對大豆根瘤固氮酶活性的影響Fig.2 Effects of the inoculations on nitrogenase activity of soybean

2.4 不同接種處理對根系的菌根侵染率的影響

通過顯微鏡觀察，無論是單接種AM真菌還是雙接種處理，所有處理的根瘤都沒有被AM真菌侵染;而根系侵染率在接種56 d時(開花期)高于28 d時(三葉期)的根系侵染率(P＜0.05);無論是28 d還是56 d，單獨接種菌根真菌或雙接種處理時，大豆側(cè)根根系侵染率顯著高于主根根系侵染率(P＜0.05)(圖3)。單獨接種菌根真菌與雙接種處理，2次收獲時主根侵染率沒有顯著性差異。但是雙接種處理在接種56 d時，結(jié)根瘤側(cè)根的侵染率顯著高于無根瘤側(cè)根侵染率。

2.5 不同接種處理對根瘤植株或根瘤氮、磷吸收的影響

無論是接種28 d還是56 d，地上部氮含量表現(xiàn)為:雙接種＞單獨接種根瘤菌＞單獨接種菌根真菌＞對照(表2)。根系氮濃度順序表現(xiàn)為雙接種＞單獨接種(根瘤菌處理或菌根真菌處理)＞對照，單獨接種根瘤菌和單獨接種菌根真菌之間根系氮濃度沒有顯著性差異。

圖3 接種處理對大豆不同根系侵染率的影響Fig.3 Effects of the inoculations on root AM colonization of soybean seedlings

相對于對照處理，2次收獲時單獨接種根瘤菌或沒有顯著提高地上部磷含量。接種處理28 d時，根系磷濃度趨勢是雙接種＞單獨接種菌根真菌＞單獨接種根瘤菌＞對照;接種處理56 d時，雙接種處理與單獨接種菌根真菌處理間根系磷濃度沒有顯著差異(表2)。

單接種根瘤菌或菌根真菌相比，無論是接種后28 d還是56 d，雙接種處理顯著提高了植株中氮、磷的含量。接種后28 d，單獨接種菌根真菌處理的植株磷的吸收效率顯著高于雙接種處理，而56 d時趨勢相反(表3)。

3 討論

從AM真菌和根瘤菌對宿主植物根的識別、侵入、在植物根內(nèi)定殖并形成可交換營養(yǎng)的界面［17］，到誘導植物根發(fā)生形態(tài)和生理上的變化［18］，最終與植物建立共生關(guān)系，都離不開植物根系分泌的信號分子的誘導。本研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌與AM真菌雙接種能夠提高側(cè)根數(shù)，增加側(cè)根上根瘤數(shù)目，增強側(cè)根根瘤的固氮能力以及提高結(jié)根瘤的側(cè)根AM真菌侵染率，但是主根根瘤固氮活性與單接種根瘤菌接種處理相比沒有顯著差異。對側(cè)根根瘤來說，在同一條側(cè)根上，根瘤活性在接種后56 d內(nèi)(開花期)隨著根瘤發(fā)育程度增加，根瘤活性增加(圖2)。通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)雙接種中所有根瘤均沒有被AM真菌侵染，但是結(jié)根瘤的側(cè)根AM真菌侵染率最高，側(cè)根中根瘤數(shù)與該側(cè)根AM真菌的侵染具有正相關(guān)性

(圖1A，圖3)。這表明雙接種時AM真菌侵染增強根瘤菌在寄主植物側(cè)根的定殖、根瘤的發(fā)育和固氮能力。這說明同一側(cè)根根內(nèi)的AM真菌侵染與根瘤菌侵染固氮之間存在著關(guān)系:AM真菌提供給植物根瘤固氮作用所需的磷素，提高植株的固氮能力，同時植株固氮為AM真菌提供良好的氮素營養(yǎng)，提高植株結(jié)根瘤的側(cè)根中AM真菌侵染率。研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌比植物體本身的氮濃度高3.7倍［19］，這說明AM真菌對氮營養(yǎng)有較高需求，AM真菌可能被根瘤中較高濃度的氮營養(yǎng)所吸引［3］。

表2 菌根真菌與根瘤菌不同接種處理對大豆根系、地上部、根瘤中氮和磷濃度的影響(mg/g，DW)Table 2 Effects of G.mosseae and/or B.japonicum inoculations on N and P concentration in shoots，roots and root nodules of soybeans at 28thand 56thday after inoculation

表3 菌根真菌與根瘤菌不同接種處理對大豆氮、磷含量及磷吸收效率的影響Table 3 Effects of G.mosseae and/or B.japonicum inoculations on N and P contents，and P uptake efficiency of soybeans at 28thand 56thday after inoculation

豆科植物通常通過增加根瘤數(shù)量來適應(yīng)缺磷脅迫［9］，根瘤數(shù)量的增加擴大與土壤接觸面積［20］。在低磷土壤中，AM真菌的缺乏將導致大豆根瘤固氮減少，甚至完全被抑制［9］。研究表明，根瘤信號(類黃酮類物質(zhì))刺激AM真菌對寄主的侵染［11］，根瘤菌也能夠促進AM真菌的侵染，促進叢枝的形成［21］。共生體的形成對植物來說是有益的，但是它也是一個耗能量的過程。許多研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌和根瘤菌對寄主中有限光合產(chǎn)物存在競爭關(guān)系［22］，一種共生體的形成會影響另一種共生體的建立［10］。本試驗結(jié)果表明，雙接種時側(cè)根有更多根瘤的形成，這顯然是由于AM真菌的存在所誘導的，不僅是根瘤數(shù)量，而且根瘤固氮酶活性與根瘤生物量都有提高。以前的研究認為，根瘤固氮酶活性及根系中磷含量與AM真菌的侵染率有正相關(guān)關(guān)系［23］。根瘤固氮酶活性提高，根瘤生物量有增加的趨勢［24］，而且AM真菌的侵染也增加了侵染植物的可溶性糖濃度［25］。因此，側(cè)根中較高的根瘤生物量和固氮酶活性可能是由于AM真菌的侵染導致的。根系具有較高的AM真菌的侵染時AM真菌提供根系更多的磷，誘導更多的碳水化合物從地上部轉(zhuǎn)運到根系的AM真菌侵染的部位，進而供給根瘤生長所需。根瘤的存在促進了側(cè)根的形成，進而為AM真菌的侵染提供新的目標［26］。結(jié)根瘤的側(cè)根提高了共生體的氮營養(yǎng)，隨即刺激了菌根真菌的侵染和叢枝的形成［21］。另一種可能性是，側(cè)根中菌根生長和叢枝形成的緊密相關(guān)過程依賴于碳的有效性［27］。以前的證據(jù)支持了我們的假說，因為根瘤有相對高的磷需求［7－8］，AM 真菌提供更多的磷營養(yǎng)給結(jié)根瘤的側(cè)根。

4 結(jié)論

菌根真菌的存在，顯著提高了大豆根系側(cè)根上根瘤數(shù)量，增強了其固氮能力，而且提高了植株在生殖生長期的磷素吸收效率。結(jié)根瘤的側(cè)根中菌根侵染率顯著提高，表明根瘤數(shù)量、分布與AMF的侵染存在正相關(guān)關(guān)系。

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